【正文】 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同決定了它對(duì)翻譯過(guò)程的影響是有差別的 。 所有的結(jié)論要通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能得出 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用 ， 大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物 ， 這種降解作用程度對(duì)不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的 ， 具有一定的專一性和選擇性 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 蛋白水解酶的特點(diǎn) 細(xì)胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域 ， 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中最容易受 到蛋白水解酶的作用 。 通過(guò)對(duì)已知大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋臼質(zhì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ， 發(fā)現(xiàn) N末 端為 Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 殘基的蛋白質(zhì) ， 含有 Pro Glu 、 Ser 、 Thr 豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解 ， 穩(wěn)定性較差 。 在細(xì)胞內(nèi)有多肽碎片 、 突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件 下 ， 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達(dá)到比較高的水平 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有： 利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間 ， 或分泌到培養(yǎng)基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌 。 對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá) 。 共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子 ， 如分子伴侶基因 。 對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造 。 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 但必須指出的是 ， 由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同 ， 上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的 。 主要表現(xiàn)為： 大腸桿菌對(duì)分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低 ， 不能滿足大規(guī)饃制備的需要 。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛 ， 生長(zhǎng)速率慢 ， 使高密度發(fā)酵比較困難 。 融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣 ， 導(dǎo)致生物比活力降低 ，甚至沒(méi)有活性 。 融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白 。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除 。 化學(xué)法比酶法成本低 ，但不少裂解試劑有毒性 。 對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) ， 而目前這方面的數(shù)據(jù)庫(kù)還不完整 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過(guò)程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過(guò)單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來(lái)實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長(zhǎng)密度較高 ， 培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低 ， 氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)速率降低和乙酸的累積 ， 乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用 。 這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問(wèn)題 。 雖然在發(fā)酵過(guò)程中可 采取通氧氣 ， 提高攪拌速度 ， 控制補(bǔ)料速度 等措施來(lái)控制溶氧飽和度 ， 減少乙酸的產(chǎn)生 。 但從實(shí)際應(yīng)用上看 ， 這些措施都有一定的滯后效應(yīng) ， 難以做到比較精確的控制 。 因此 構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 ， 是從恨本上解決問(wèn)題的途徑之一 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對(duì)氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì) ， 把透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對(duì)溶氧的寬容度 。 從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值 。 用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因 ackA， 使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷 。 改變代謝流的方向 ， 通過(guò)共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌 、 釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS， 單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌 ， 使丙酮酸的代謝有選擇地向生成 3‘羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 對(duì)于以可溶性或分泌形式表達(dá)的目標(biāo)蛋日而言 ， 隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積 ， 目標(biāo)蛋白會(huì)遭到蛋白水解酶的作用而被降解 。 為了使對(duì)蛋白水解酶比較敏感的目標(biāo)蛋白也能獲得較高水平的表達(dá) ， 需要 構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 。 rpoH 基因編碼大腸桿菌 RNA 聚合酶的 r32 亞基 ， r32 亞基對(duì)大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用 。 rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建 ， 研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平 。 到目前為止 ， 已知的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得 ， 其中一部分具有實(shí)際應(yīng)用的潛力 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 構(gòu)建各種表達(dá)載體 建立新的表達(dá)系統(tǒng) 目前研究的重點(diǎn)完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中還存在的缺陷 等方面。這些研究工作主要包括 : 重組蛋白質(zhì)的正確折疊、構(gòu)象形成和分泌 菌體表面表達(dá)技術(shù)及其應(yīng)用 重組蛋白質(zhì)修飾加工研究 共表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊過(guò)程密切相關(guān)的分子伴侶 包涵體是由于在新合成的大量目標(biāo)蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程中 ， 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)參與折疊的蛋白因子的量不能滿足需要 ， 無(wú)法形成正確的構(gòu)象而產(chǎn)生的 ， 因此在大腸桿菌內(nèi)共表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊過(guò)程密切相關(guān)的 分子伴侶 ，折疊酶 或 硫氧還蛋白 基因可以使目標(biāo)基因可溶性表達(dá)的比例明顯上升 。 研究表明這種作用是具有 專一性 的 ， 不同的目標(biāo)蛋白需要不同類型的蛋白因子共表達(dá) 。 在有些情況下需要有多個(gè)蛋白因子共表達(dá)才能達(dá)到預(yù)期的目標(biāo) 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 共表達(dá)人或小鼠的二硫鍵異構(gòu)酶、促進(jìn)二硫鍵形成和正確折疊 大腸桿菌周質(zhì)空間通過(guò) 二硫鍵形成酶 DsbA 和 DsbB 二個(gè)蛋白維持適 當(dāng)?shù)难趸€原態(tài)勢(shì)使蛋白質(zhì)的二硫鍵形成。 共表達(dá)人或小鼠的蛋白質(zhì) 二硫鍵異構(gòu)酶 （ PDl） PDl 能互補(bǔ) dsbA 缺陷株，但在 dsbB 缺陷株中 PDl 失去原有的 功能 。 PDl 對(duì)目標(biāo)蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進(jìn)作用可以受到谷 胱甘肽的調(diào)節(jié)。 PDI 具有的二硫鍵異構(gòu)，交換功能有效地彌補(bǔ)了 DsbA 和 DsbB 功能上的不足，從而提高了目標(biāo)蛋白正確折疊的比例 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 降低蛋白質(zhì)合成的速率 ， 從而增加正確折疊重組蛋白質(zhì) 從 phoA 基因 合成速率低的突變株 中發(fā)現(xiàn)其分泌在周質(zhì)空間的 phoA 基 因的產(chǎn)物 堿性磷酸酯酶比野生型菌株有 顯著增加 ， 由于只有構(gòu)象正 確的酶原才能被大腸桿菌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別和分泌 ， 這一結(jié)果表明了目 標(biāo)蛋白合成的速率能對(duì)其構(gòu)象形成正確與否產(chǎn)生影響 。 采用 較弱的啟動(dòng)子 或 部分誘導(dǎo)強(qiáng)啟動(dòng)子 的方法可降低蛋白質(zhì)合成的速 率 ， 從而達(dá)到增加正確折疊重組蛋白質(zhì)的目的 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 改造信號(hào)肽的序列和結(jié)構(gòu)，提高分泌效率 改造 信號(hào)肽 的序列和結(jié)構(gòu) ， 提高分泌效率 比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把堿性磷酸酯酶基因 phoA 信號(hào)肽的疏水區(qū) 置換為多聚 Leu 殘基能明顯提高分泌效率 。 表明信號(hào)肽核心部位疏水 性的增強(qiáng)有利于它與細(xì)胞膜的相互作用 。 這一結(jié)果為天然信號(hào)肽優(yōu)化 改造的設(shè)計(jì)提供了很好的參考依據(jù) 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 大腸桿菌表面表達(dá)技術(shù)的建立 膜蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá)的技術(shù)逐漸成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域 ， 膜蛋 白表達(dá)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了大腸桿菌表面表達(dá)技術(shù)的建立 。 外源蛋白質(zhì)在菌體表面表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是大腸桿菌可直接用于制備疫苗 ， 進(jìn)行生物催化和作為探針篩選藥物 。 在一定程度上能與噬菌體展示系 統(tǒng)相媲美 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 大腸桿菌表面表達(dá)技術(shù)的建立 主要通過(guò)三條途徑使目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)在菌體表面 : 把外源序列插入 LamB 、 OmpA、 PhoE 等外膜蛋白的膜外區(qū) 把外源蛋白導(dǎo)入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結(jié)構(gòu)中 這二種方法適合表達(dá)一段長(zhǎng)度小于 100 個(gè)氨基酸殘基的外源序列， 因?yàn)檩^大的外源序列的插入往往會(huì)使外膜蛋白不能形成原來(lái)的三維 結(jié)構(gòu)，影響它轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和在膜上的定位。 在脂蛋白、 IgA 蛋白酶、 ompA 基因的 N 端或 C 端融合外源基因 這種融合表達(dá)的方法對(duì)外源基因的限制條件就比較小，其序列可在 50 到 500 氨基酸殘基長(zhǎng)度的范圍內(nèi)。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 重組蛋白質(zhì)修飾加工研究 蛋白質(zhì) C末端酰胺化 和 側(cè)鏈糖基化 是常見(jiàn)的翻譯后修飾加工類型 目前 C末端酰胺化一般都是在體外通過(guò) 肽酰甘氨酸酰胺酶 把 C末端甘氨酸轉(zhuǎn)換為胺基 把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺化酶，真核生物糖基化過(guò)程所涉及的酶系導(dǎo)入大腸桿菌的設(shè)想很早就被提出，但這些工作都還在探索之中。其中需要研究的主要問(wèn)題有 : 如何使肽酰甘氨酸酰胺化酶在大腸仟菌內(nèi)有較高的活力和專一性 。 如何通過(guò)基因工程技術(shù)改道真核生物的糖基化多酶體系使其能整合到 大腸桿菌的染色體中和對(duì)耱基化位置、糖基種類和長(zhǎng)度進(jìn)行控制等。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì)