20xx年醫(yī)學(xué)專題—人重組白細(xì)胞介素-8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定(存儲版)
【正文】 ；其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)ZML聚合反應(yīng)（即錯配）。而本試驗酶切位點(diǎn)設(shè)計在下游3’引物上，并且增加了ccg三個堿基來保護(hù)酶切位點(diǎn)，是酶切更高效[3]。經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理后，小批量誘導(dǎo)hlL8表達(dá)，經(jīng)純化后，進(jìn)行ELISA雙抗體夾心法檢測，由圖2可以大致估算出hlL8的濃度[4]。本試驗成功地構(gòu)建了hlL18重組原核表達(dá)質(zhì)粒，利用大腸桿菌成功地表達(dá)了重組蛋白，為進(jìn)一步研究hIL18的功能及應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。所以綜合以上情況，本實驗采用第三種辦法。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。3 討論本實驗首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增hlL18cDNA，反應(yīng)結(jié)束后取出少量做瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)圖1的結(jié)果可以看出，引物的設(shè)計和PCR反應(yīng)條件的設(shè)計是很成功的。洗滌：同前。加10μl連接好的質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘，37℃水浴2分鐘，冰浴2分鐘。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。37℃水浴45分鐘。加200μl乙酸緩沖液，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次混勻，冰浴10分鐘（寧短勿長）。DNA樣品10μl加5μlGEBS樣本液，在蠟面紙上混勻，全部加樣于瓊脂糖的樣品孔中。在設(shè)定好的PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。內(nèi)切酶StyⅠ、XbaⅠ購于Takara公司。由于天然來源的IL8含量極低，難以大批量制備，因而只能利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。人重組白細(xì)胞介素8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定【摘要】目的 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hIL8 cDNA，將其連接于原核表達(dá)載體pKpL3a（含PL啟動子）中,并在大腸桿菌中表達(dá)、鑒定。另外，IL8還具有促進(jìn)造血細(xì)胞增殖及新生血管生成作用，在傷口愈合和腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。Klenow酶購于北聯(lián)生物醫(yī)學(xué)工程公司。最后72℃再延伸5分鐘。充分凝固后從制膠槽中卸下凝膠板，放入電泳槽，加入TAE（1），使其液面略高于瓊脂糖板，拔出樣品梳。加200μl堿溶液裂解細(xì)菌，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次至溶液清亮，開蓋后能拉出絲狀粘稠液體。B管：ddH2O 14μl 、10M buffer 2μl、%BSA 2μl、PCR產(chǎn)物1μl、XbaⅠ1μl。B管中加50μl酚氯仿異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，20℃沉底1小時。加200μl 100mM Cacl2混勻，冰浴30分鐘。加酶標(biāo)抗體：100μl/孔，100μl/孔，放置濕盒中，37℃ 30分鐘。表1
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