20xx年醫(yī)學(xué)專題—人重組白細(xì)胞介素-8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定-wenkub
2024-11-19 05 本頁面
【正文】 ，拔出樣品梳。加入50μl酚氯仿異戊醇并混勻，10000rpm，30秒離心。最后72℃再延伸5分鐘。 主要儀器PCR儀，微量加樣器（20μl、200μl、1000μl），高速臺(tái)式離心機(jī)，DYY10型電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)，水浴搖床，孵箱，酶標(biāo)儀，一次性酶標(biāo)板等。Klenow酶購于北聯(lián)生物醫(yī)學(xué)工程公司。這種生物工廠一旦建造成功, 只要供給大腸桿菌適當(dāng)?shù)纳L條件, 就可提供取之不盡的IL8。另外，IL8還具有促進(jìn)造血細(xì)胞增殖及新生血管生成作用，在傷口愈合和腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)論：hIL8成功在大腸桿菌中表達(dá)。人重組白細(xì)胞介素8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定【摘要】目的 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hIL8 cDNA，將其連接于原核表達(dá)載體pKpL3a（含PL啟動(dòng)子）中,并在大腸桿菌中表達(dá)、鑒定?！娟P(guān)鍵詞】hIL8 PCR 重組基因 表達(dá)正文趨化因子（Chemokine）是一組具有趨化作用的細(xì)胞因子，能吸引免疫細(xì)胞到免疫應(yīng)答局部，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。由于天然來源的IL8含量極低，難以大批量制備，因而只能利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。1 材料與方法 主要材料 菌株與載體Pop2136大腸桿菌和含pKpL3a質(zhì)粒的大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室提供。內(nèi)切酶StyⅠ、XbaⅠ購于Takara公司。 試驗(yàn)方法 PCR技術(shù)擴(kuò)增hIL8cDNA在Eppendorf管中依次加入下列成份構(gòu)建總體積為50μl的反應(yīng)體系：ddH2O 37μl、10buffer 5μl、dNTPmix 5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA模板1μl、Taq酶 1μl。在設(shè)定好的PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。吸取上層清液轉(zhuǎn)至另一已加入5μl 3M ，加入150μl無水乙醇，20℃放置1小時(shí)。DNA樣品10μl加5μlGEBS樣本液，在蠟面紙上混勻，全部加樣于瓊脂糖的樣品孔中。 質(zhì)粒提取從轉(zhuǎn)化平皿上接種一單菌落到LA培液體養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)，待細(xì)菌濃度增至OD600=，收獲細(xì)菌。加200μl乙酸緩沖液，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次混勻，冰浴10分鐘（寧短勿長）。加入50μl TE使質(zhì)粒溶解，酶切備用。37℃水浴45分鐘。加50μl酚氯仿異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，20℃沉底1小時(shí)。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。65℃水浴15分鐘，滅活T4 DNA連接酶，用于轉(zhuǎn)化。加10μl連接好的質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘，37℃水浴2分鐘，冰
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