【正文】 ,叫作固相反應(yīng)劑。 固相反應(yīng)劑的種類很多,包括氧化型、還原型、基團(tuán)轉(zhuǎn)移型和催化劑型,可適應(yīng)各種衍生化反應(yīng)的需要。 樣品通過時與反應(yīng)劑發(fā)生衍生化反應(yīng),這是一種非均勻體系的反應(yīng)。 大分子只能與擔(dān)體表面的試劑作用,而小分子可以進(jìn)入擔(dān)體的所有反應(yīng)部位,因此當(dāng)有大分子干擾物存在時,只有痕量大分子發(fā)生衍生化,不干擾小分子待測物的檢測。,柱后衍生(yǎn shēnɡ)化的一種形式,第九十八頁，共一百二十一頁。,特點(t232。diǎn)：,①反應(yīng)試劑的局部濃度很高,有利于反應(yīng)進(jìn)行完全。 ②過量衍生化試劑不會進(jìn)入檢測器,降低了檢測(jiǎn c232。)本底,提高靈敏度。 ③反應(yīng)速度取決于溶液接觸的表面積(填料粒度),由于填料粒度小,因而反應(yīng)速度快。 ④反應(yīng)受色譜流動相的影響小。 ⑤不需額外的混合器、管線、接頭等,減少了峰展寬因素。,第九十九頁，共一百二十一頁。,(3)固定化酶衍生(yǎn shēnɡ)化,最早期把一種酶連接于螺旋管的內(nèi)壁就是最早最簡單的酶反應(yīng)器。 現(xiàn)代的固定化酶反應(yīng)器都是將酶固定在擔(dān)體上,這實際上是一種特殊的催化劑型固相衍生化試劑。 優(yōu)點：酶反應(yīng)的專一性很強(qiáng),因此方法的選擇性很高。固定化后,酶的穩(wěn)定性大大提高,而且可以重復(fù)使用。 缺點：固定化酶的工作(gōngzu242。)穩(wěn)定性受擔(dān)體、溫度、溶劑、pH和酶抑制劑的影響。 如果溶劑及其pH不合適,就可能使酶迅速失去活性。HPLC流動相中的固體微粒、細(xì)菌、某些金屬離子等都有可能使酶失去活性,應(yīng)當(dāng)除去。,固相衍生(yǎn shēnɡ)化的一種特殊型式,第一百頁，共一百二十一頁。,(4)光化學(xué)衍生(yǎn shēnɡ)化,光化學(xué)衍生化是使色譜柱流出的組分在光照射下發(fā)生某種反應(yīng),所產(chǎn)生的衍生物再被檢測(jiǎn c232。)器檢測(jiǎn c232。)。 只需在色譜柱與檢測器間 安裝一個光源和一段反應(yīng)管。 光源：高強(qiáng)度紫外燈、激光 反應(yīng)管可以纏繞在光源上, 或者編織成套直接套在光電管上。 檢測器：紫外可見檢測器、熒光檢測器或電化學(xué)檢測器。,柱后衍生(yǎn shēnɡ)化的一種形式,第一百零一頁，共一百二十一頁。,成功的光化學(xué)衍生化必須(b236。xū)符合下列條件:,①待測組分能夠吸收適宜波長的光,可以想象它們應(yīng)該是芳香(fāngxiāng)或共軛不飽和化合物。 ②色譜洗脫液對上述波長的光應(yīng)該透明。 ③光源在上述波長處有足夠的光通量(光強(qiáng))。 ④光反應(yīng)足夠迅速。 ⑤反應(yīng)產(chǎn)物足夠穩(wěn)定,而且能用上述檢測器之一進(jìn)行檢測。,第一百零二頁，共一百二十一頁。,光化學(xué)衍生化的主要(zhǔy224。o)特點：,①價格低廉,光可能是最便宜的衍生化試劑。 ②設(shè)備簡單(jiǎndān),不需額外儀器(泵等),也不需要任何衍生化試劑,減少了污染。 ③在恒流條件下,有恒定和重現(xiàn)的動力學(xué)參數(shù)。 因此,使反應(yīng)不完全甚至未達(dá)平衡,能進(jìn)行定量測定。,第一百零三頁，共一百二十一頁。,三、GC柱后衍生(yǎn shēnɡ)化,(1)柱后裂解器 裂解器是一個石英或金線圈或者是一個氧化還原器,在反應(yīng)器后檢測分析各色譜組分裂解產(chǎn)生的C、H、O和N元素。柱后裂解能對色譜峰進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定,這一點與MS的作用(zu242。y242。ng)相似。 (2)柱后濃集器 柱后濃集器主要用于GCMS,但是也能改善其他檢測器的信噪比。 濃集器主要有四類,即噴射分離器、燒結(jié)玻璃分離器、多孔膜和高聚膜。,第一百零四頁，共一百二十一頁。,(3)柱后反應(yīng)器,有一種含有鎳硅藻土催化劑的微型反應(yīng)器,加熱至425℃ 時,能允許(yǔnxǔ)氫氣自由通過,而其他組分則裂解成甲烷和水。除去水后,以熱導(dǎo)池檢測甲烷。 氫反應(yīng)器能使色譜峰中含有鹵素或氮的組分還原成氫鹵酸和氨,然后進(jìn)行庫侖檢測或電導(dǎo)檢測。 另一種氫反應(yīng)器將含氮化合物轉(zhuǎn)變成氨后,再流進(jìn)一個裝置與鄰苯二甲醛(OPA)和巰基乙醇反應(yīng),并進(jìn)行熒光檢測。,第一百零五頁，共一百二十一頁。,四、用于液相色譜(s232。 pǔ)的化學(xué)衍生化,須滿足的要求： ①反應(yīng)能迅速、定量地進(jìn)行,而且對反應(yīng)條件要求不苛刻。 ②反應(yīng)的選擇性高,最好只與待分析組分發(fā)生(fāshēng)反應(yīng)。 ③過量的衍生化試劑或反應(yīng)的副產(chǎn)物不干擾樣品的分離和檢測。 ④衍生化試劑方便易得。,第一百零六頁，共一百二十一頁。,選擇衍生化試劑(sh236。j236。)要考慮的因素,首先要考慮的是待測化合物的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì),根據(jù)這一點可以找出可能合適的衍生化反應(yīng)及相應(yīng)的分離和檢測方法。 其次還要考慮樣品基質(zhì)和可能存在的干擾物質(zhì)的影響,有時可能要進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x或凈化后才能進(jìn)行衍生化反應(yīng)。 最后還要考慮將要采用(cǎiy242。ng)的色譜系統(tǒng)是否與之匹配。,第一百零七頁，共一百二十一頁。,可見(kěji224。n)紫外衍生化,A、胺類和氨基酸的衍生化 例如：許多藥物和內(nèi)源性生物活性物質(zhì)都含有氨基,其典型代表是氨基酸。 利用親核取代反應(yīng)可以將伯胺和仲胺轉(zhuǎn)化成芳香(fāngxiāng)衍生物,常用的化學(xué)衍生化試劑是苯甲酰氯、芳基磺酰氯、異硫氰酸酯和硝基苯。 化學(xué)反應(yīng)式：,引入發(fā)色基團(tuán)(jī tu225。n),衍生化試劑：高度共軛的芳香化合物,第一百零八頁，共一百二十一頁。,B、羧酸(suō suān)的衍生化,羧酸類化合物包括有重要生物活性的脂肪酸、前列腺素、膽汁酸和有機(jī)酸藥物(y224。ow249。)。 最常用的衍生化試劑是苯甲酰甲基溴和萘甲酰甲基溴。 羧酸還可以先轉(zhuǎn)化成酰鹵再與芳香胺反應(yīng)生成可進(jìn)行紫外檢測的酰胺。 (1)苯甲酰甲基溴和萘甲酰甲基溴類試劑 (2)芳香胺類試劑,第一百零九頁，共一百二十一頁。,C、羥基(qiǎngjī)化合物的衍生化,羥基化合物包括類固醇和氨基糖苷類抗生素,還有醇和酚。 羥基化合物很容易(r243。ngy236。)轉(zhuǎn)化成酯,最常用的紫外可見衍生化試劑是酰氯,還有異氰酸苯酯(PIC)。 (1)酰氯類試劑：苯甲酰氯及其衍生物 (2)異氰酸苯酯(PIC),第一百一十頁，共一百二十一頁。,D、羰基(tānɡ jī)化合物的衍生化,2,4二硝基苯肼(2,4DNPH)是較早應(yīng)用于酮、醛、羰基甾體和糖等羰基化合物的可見紫外衍生(yǎn shēnɡ)化試劑,產(chǎn)物為苯腙化合物,其反應(yīng)式為:,第一百一十一頁，共一百二十一頁。,熒光(y237。ngguāng)衍生化,HPLC的熒光檢測器靈敏度比紫外檢測器高得多,適合半痕量分析。 但是大多數(shù)藥物及生命重要物質(zhì)如氨基酸、生物胺、甾體和脂肪酸等本身都不具有熒光,因此(yīncǐ)必須與熒光衍生化試劑反應(yīng)接上能產(chǎn)生熒光的基團(tuán)后才能進(jìn)行熒光檢測。 熒光衍生物的激發(fā)波長和發(fā)射波長往往與試劑本身不同,因此熒光衍生化反應(yīng)既可在柱前也可在柱后進(jìn)行。 熒光衍生物都有紫外吸收,因此也可用紫外檢測,但紫外檢測靈敏度比熒光檢測低1~3個數(shù)量級。,第一百一十二頁，共一百二十一頁。,熒光(y237。ngguāng)衍生化試劑,(1)磺酰氯類試劑 (2)氯甲酸酯類試劑 (3)異硫氰酸酯 (4)熒光胺 (5)含有(h225。n yǒu)羰基的試劑 鄰苯二甲醛(OPA) (6)鹵代硝基苯并2惡1,3二唑類試劑 (7)氨基甲酸酯類試劑,A、胺類和氨基酸的熒光(y237。ngguāng)衍生化,第一百一十三頁，共一百二十一頁。,B、羧酸(suō suān)的熒光衍生化,(1)香豆素類試劑：4溴甲基7甲氧基香豆素 (2)芳胺和醇作為衍生(yǎn shēnɡ)化試劑：9,10二氨基菲(DAP),C、羥基化合物的熒光(y237。ngguāng)衍生化,D、羰基化合物的熒光衍生化,(1)肼類試劑：丹磺酰肼 (2)鄰苯二胺及其類似試劑,7甲氧基香豆素3碳酰疊氮+伯醇/仲醇,第一百一十四頁，共一百二十一頁。,電化學(xué)衍生(yǎn shēnɡ)化,電化學(xué)衍生化是使樣品組分與衍生化試劑反應(yīng),生成具有電化學(xué)活性的衍生物,以便對電化學(xué)檢測有較靈敏的響應(yīng)(xiǎngy236。ng)。 常見的電化學(xué)活性基團(tuán)包括氧化法檢測的酚和芳胺及能用還原法檢測的硝基苯。 氧化電化學(xué)檢測法是優(yōu)先考慮的方法,因此具有(或能生成)前兩類基團(tuán)的衍生化試劑更為常用。,第一百一十五頁，共一百二十一頁。,衍生(yǎn shēnɡ)化試劑,(1)胺類和氨基酸的電化學(xué)衍生化 ① 酰氯和酸酐類試劑 ② 二戊鐵類試劑 ③ 其他(q237。tā)電化學(xué)衍生化試劑 (2)羧酸的電化學(xué)衍生化 (3)羰基化合物的電化學(xué)衍生化,第一百一十六頁，共一百二十一頁。,五、用于氣相色譜的衍生(yǎn shēnɡ)化反應(yīng),GC柱前衍生化主要是將難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定化合物通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變成易揮發(fā)和穩(wěn)定的化合物,然后再進(jìn)行GC分析。 硅烷化是最典型的衍生化反應(yīng)(fǎny236。ng),此外酯化、?；?、烷基化、裂解、縮合和成環(huán)反應(yīng)等也是常用的反應(yīng)。 由于利用了這些衍生化反應(yīng),使GC在分析不穩(wěn)定生物活性物質(zhì)和藥物方面取得了重大成就。,第一百一十七頁，共一百二十一頁。,硅烷化反應(yīng)(fǎny236。ng),含有質(zhì)子性基團(tuán)(jī tu225。n)的化合物與硅烷化試劑反應(yīng)形成揮發(fā)性的硅烷衍生物,一般反應(yīng)式為: R3Si—X+H— R′—— R3Si—R′ +HX 最常用的硅烷化試劑是三甲基硅烷(TMS) 即R為一CH3。,第一百一十八頁，共一百二十一頁。,酯化反應(yīng)(fǎny236。ng),羧酸的極性較強(qiáng),常與GC的“惰性”固定相發(fā)生非特異性作用,產(chǎn)生拖尾峰。羧酸的揮發(fā)性也差,由于締合作用,其揮發(fā)性比按分子量大小預(yù)計的還要弱,因此難于用GC直接(zh237。jiē)分析羧酸。 而羧酸酯的極性較弱,揮發(fā)性也強(qiáng),很符合GC的要求,所以許多羧酸在GC測定之前都要衍生化成相應(yīng)的酯,最常用的是甲基酯。,羧酸(suō suān)類化合物衍生化,第一百一十九頁，共一百二十一頁。,?；磻?yīng)(fǎny236。ng),?；芙档土u基、氨基、巰基的極性,改善這些化合物的色譜性能,?；€能增加氨基酸、糖類等化合物的揮發(fā)性,也能使兒茶酚胺等易于氧化的化合物的穩(wěn)定性增強(qiáng)。 電子捕獲檢測器(ECD)是GC的最靈敏檢測器,適合于低濃度分析,如果通過?；磻?yīng)引入含有鹵原子的酰基就能進(jìn)一步提高ECD檢測的靈敏度。 ?；噭┯腥悾乎｛u、酸酐(suāngān)和有反應(yīng)活性的?；锶缫阴＿溥?應(yīng)根據(jù)需要進(jìn)行選擇。,第一百二十頁，共一百二十一頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),第六章 獸藥殘留檢測技術(shù)。此外,還有一些生物樣品中的藥物需進(jìn)行衍生化,若采用常規(guī)的液液萃取,在一定溫度下?lián)]發(fā)去有機(jī)溶劑后再進(jìn)行衍生化,則在加熱過程中會導(dǎo)致藥物分解或隨溶劑一起揮發(fā),因此也宜將這些樣品經(jīng)凍干處理后再行衍生化。以結(jié)合狀態(tài)(zhu224。ngt224。i)存在的藥物大多存在于尿中,但也存在于肝臟和血液中。水解后的樣品呈強(qiáng)酸性,必要時可用堿液調(diào)整pH后再進(jìn)行萃取,第一百二十一頁，共一百二十一