【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 4。n),甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有機(jī)溶劑,尤以甲醇和乙腈為最常用。 甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離,得到澄清的上清液。 乙腈與蛋白形成致密沉淀,易離心除去,沉淀效率較甲醇高。 使用時(shí)應(yīng)加入足量的沉淀劑,通常加入量為樣品(y224。ngpǐn)體積的1.5~2倍。,第五十三頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,酸性(suān x236。nɡ)沉淀,常用的酸性沉淀劑有三氯醋酸和高氯酸,其他還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。 酸性沉淀劑能同蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子形成不溶鹽而沉淀,必要條件是溶液的pH要低于蛋白的等電點(diǎn)。 加入沉淀劑之后立即(l236。j237。)形成白色沉淀(必要時(shí)可加熱使沉淀完全),離心后可得到澄明的上清液。,第五十四頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,三氯醋酸(常用10%溶液)沉淀蛋白的作用很強(qiáng),因此最常使用,但應(yīng)注意試劑中含有的雜質(zhì),將它們引入離心后的上清液中,可能會(huì)干擾藥物的分析。 其次應(yīng)注意,當(dāng)上(dānɡ sh224。nɡ)清液再用乙醚等有機(jī)溶劑萃取時(shí),三氯醋酸則連同溶入其內(nèi)的雜質(zhì)會(huì)進(jìn)入有機(jī)相,也可能干擾藥物的分析。 采用高氯酸作為蛋白沉淀劑時(shí),其優(yōu)點(diǎn)是殘留在上清液中的ClO4可加入鉀鹽除去。,第五十五頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,無(wú)機(jī)鹽沉淀(ch233。ndi224。n),一些無(wú)機(jī)鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等,能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷,使蛋白質(zhì)失去膠體性質(zhì)而沉淀下來(lái)。 無(wú)機(jī)鹽中以硫酸銨最常用。 常用的重金屬鹽類(lèi)有汞鹽、銅鹽和鋅鹽等,它們能與蛋白質(zhì)形成不溶鹽而沉淀析出。 如可用HgCl2作為蛋白沉淀劑處理血漿樣品,離心后用比色法測(cè)定上清液中的水楊酸濃度。 采用蛋白沉淀劑,只要加入足量,一般(yībān)可除去98%以上的蛋白。蛋白沉淀后是否與之相結(jié)合的藥物能游離釋出,目前尚缺乏系統(tǒng)的研究資料,僅觀察到少數(shù)現(xiàn)象。,第五十六頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,透析法,透析法與超濾法也是除去樣品中蛋白的方法。 透析法很費(fèi)時(shí),溶質(zhì)透過(guò)膜的程度與被測(cè)物的性質(zhì)、溫度有關(guān),膜需常常更新,很難自動(dòng)化,因此透析法一般不用于常規(guī)分析,而用于藥物在生物(shēngw249。)樣品中蛋白結(jié)合率的研究。,第五十七頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,超濾法,超濾法是另一種除去樣品中蛋白和其他大分子的方法,也是一種薄膜分離技術(shù)。 與蛋白沉淀法相比,其優(yōu)點(diǎn)是適用于小量樣品,不稀釋試樣,也不改變?cè)嚇拥膒H,尤其適于含對(duì)酸堿不穩(wěn)定的化合物的樣品,用于樣品的濃縮(n243。nɡ suō)、脫鹽、不同分子尺寸的分離。 如果待測(cè)物易被某種酶分解,那么超濾除去該酶后就避免了待測(cè)物的分解。在殘留分析中超濾法常用于牛奶、血液中游離藥物濃度和藥物血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定。 超濾法的缺點(diǎn)是待測(cè)物可能被結(jié)合在濾膜上而影響回收率,而且一些能與大分子蛋白結(jié)合的藥物也會(huì)隨著蛋白質(zhì)被除去而丟失。,第五十八頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,五、冷凍干燥,冷凍干燥是貯存和預(yù)處理某些生物樣品的有效方法,適合于處理量大的樣品。 例如,一些樣品中所含藥物水溶性很強(qiáng)(不容易被有機(jī)溶劑萃取),可凍干后再進(jìn)行液固萃取。 凍干法也適用于一些含揮發(fā)性藥物的樣品以及對(duì)熱不穩(wěn)定的樣品。 此外,還有一些生物樣品中的藥物需進(jìn)行衍生化,若采用常規(guī)的液液萃取,在一定溫度(wēnd249。)下?lián)]發(fā)去有機(jī)溶劑后再進(jìn)行衍生化,則在加熱過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致藥物分解或隨溶劑一起揮發(fā),因此也宜將這些樣品經(jīng)凍干處理后再行衍生化。,第五十九頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,生物樣品凍干時(shí),可先將其置干冰丙酮浴中、液氮中或其他低溫條件下,半固體樣品如糞便、組織等冷凍時(shí)間約1~10min。冷凍后水分在樣品表面形成“冰殼”,增加了揮發(fā)面積,再將其放入凍干機(jī)內(nèi)減壓,冰則直接(zh237。jiē)升華,和其他揮發(fā)性雜質(zhì)一起被除去,使樣品干燥。 凍干后的樣品通?？芍苯蛹尤胗袡C(jī)溶劑萃取。 凍干時(shí)應(yīng)注意某些揮發(fā)性強(qiáng)的藥物可能揮發(fā)損失。,操作步驟,第六十頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,六、結(jié)合物水解(shuǐjiě),以結(jié)合狀態(tài)存在的藥物大多存在于尿中,但也存在于肝臟和血液中。常用的結(jié)合物水解的方法有: (1)酸水解 酸水解通常使用無(wú)機(jī)酸,如尿樣中結(jié)合物水解可加入適量的鹽酸液。 加入鹽酸的濃度、酸化時(shí)間以及是否需要加熱等,隨藥物而異,但最終應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定(qu232。d236。ng)。 水解后的樣品呈強(qiáng)酸性,必要時(shí)可用堿液調(diào)整pH后再進(jìn)行萃取。,藥物在體內(nèi)(tǐ n232。i)經(jīng)代謝反應(yīng)之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等結(jié)合物,第六十一頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,(2)酶水解(shuǐjiě),酶水解是專一性很強(qiáng)的水解結(jié)合物的方法。 通常使用的水解酶是β葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專門(mén)水解藥物的葡萄糖醛酸苷,后者水解藥物的硫酸(li suān)酯。 也可用兩者的混合物,將生物樣品中藥物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同時(shí)水解。 尿液中通常存在以上兩種結(jié)合物,因此混合酶水解法具有實(shí)用價(jià)值。,第六十二頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,(3)溶劑解,某些(mǒu xiē)藥物或內(nèi)源化合物的硫酸酯,可隨加入的萃取溶劑,在萃取過(guò)程中發(fā)生分解,通常稱為溶劑解。 溶劑解也是分解結(jié)合物較溫和的一種方法。,第六十三頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,七、樣品提取(t237。qǔ)和凈化,液液萃取 液液萃取是經(jīng)典的提取方法之一,它基于被測(cè)組分在不相溶的兩種溶劑中的分配。 與其他方法相比,液液萃取法仍是目前最常用的樣品處理方法,其原因是: ①通過(guò)萃取可將被測(cè)組分自大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)中分離出來(lái),減少雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾。 ②操作簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。 ③可將萃取液蒸發(fā),使組分富集。 ④可一次進(jìn)行(j236。nx237。ng)同類(lèi)組分的萃取。,提取→凈化(j236。nghu224。)→濃縮→色譜分析,第六十四頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,液液萃取的溶劑(r243。ngj236。)選擇,液液萃取常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。 溶劑選擇應(yīng)注意以下幾點(diǎn): ①溶劑的極性，根據(jù)相似相溶原理,極性組分(zǔf232。n)易溶于極性溶劑,反之亦然,應(yīng)根據(jù)被測(cè)組分的極性選擇相似極性的溶劑。 實(shí)際萃取被測(cè)組分時(shí),還常于萃取溶劑中加人第二種溶劑,以調(diào)整極性,使達(dá)到選擇性萃取。,第六十五頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,②溶劑的沸點(diǎn)，萃取分離后的有機(jī)相通常需置溫水浴中通壓縮空氣(或氮?dú)?使揮發(fā),將被測(cè)組分濃集,因此萃取溶劑的沸點(diǎn)就不應(yīng)接近或高于水的沸點(diǎn),否則揮發(fā)困難。 ③溶劑的毒性，使用對(duì)人體有害的溶劑萃取時(shí),應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。 在常用溶劑中,乙酸乙酯既安全又無(wú)毒,對(duì)不同(b249。 t243。nɡ)極性的被測(cè)組分均有較高的萃取回收率,又易于揮發(fā),萃取物中混入的內(nèi)源雜質(zhì)量少,是較理想的首選溶劑。,第六十六頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,④溶劑與水的互溶性 有的溶劑如乙醚,萃取后可混入大約1.2%的水分,因此伴隨帶入一些水溶性雜質(zhì)。 乙醚萃取能力強(qiáng),又易于揮發(fā)濃縮,為常用萃取溶劑,除去(ch q249。)混入水分的方法是加入無(wú)水Na2SO4脫水,減少混入的水溶性雜質(zhì)量。 萃取時(shí)于水相中加入有機(jī)相后,一般只萃取一次。特殊情況下(如雜質(zhì)不易除去),則必須將第一次萃取分出的含藥有機(jī)相,再用一定pH的水溶液反萃取,最后再?gòu)乃鄬⑺幬镙突氐接袡C(jī)相中。,第六十七頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,萃取溶劑(r243。ngj236。)與水的比例,萃取過(guò)程中加入的有機(jī)溶劑并非越多越好,而應(yīng)適量。 一般有機(jī)相與水相容積比以1:1或2:1為佳,據(jù)被測(cè)組分的性質(zhì)及方法需要,有時(shí)也增加有機(jī)相的比例。 另外,萃取時(shí)若往水相中加入少量比重大的有機(jī)溶劑(如氯仿),而該溶劑對(duì)藥物的溶解度又比較大,則可將藥物從水相中濃集于小體積的有機(jī)相中,若萃取時(shí)使用的是尖底試管,則富含藥物的有機(jī)相沉積于管尖部位,可直接取樣(qǔy224。ng)分析,或?qū)⑵浞蛛x出來(lái)。,第六十八頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,離子(l237。zǐ)對(duì)試劑,一些酸性或堿性(jiǎn x236。nɡ)較強(qiáng)的有機(jī)藥物在體液中呈離解狀態(tài),成為親水性極強(qiáng)的帶電荷離子,即使控制pH也不能抑制它們的電離,不能用有機(jī)溶劑將其自體液中提取出來(lái)。 對(duì)于上述呈離解狀態(tài)的藥物,可加入離子對(duì)試劑,使它們形成具有一定脂溶性的離子對(duì)絡(luò)合物,用有機(jī)溶劑將其從水相中萃取出來(lái)。 陽(yáng)離子藥物配對(duì)的離子對(duì)試劑則為陰離子,其中以烷基磺酸鹽類(lèi)(RSO3H)為最常用。,第六十九頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,陰離子藥物(y224。ow249。)配對(duì)的離子對(duì)試劑主要為烷基季銨類(lèi)化合物,可用通式R4N+ X表示,X可為酸根或氫氧基,R為烷基。 烷基碳鏈長(zhǎng)度常用C4~C12,甚至可選用C20,碳鏈越長(zhǎng)，則生成的離子對(duì)絡(luò)合物脂溶性越高。 常用的烷基季銨中有四丁基銨、四戊基銨等,商品試劑常用其鹽,如磷酸四丁基銨、硫酸氫四丁基銨,或?yàn)槠錃溲趸瘔A,如氫氧化四丁基銨。,第七十頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,注意事項(xiàng)：,液液提取有時(shí)會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象以及被測(cè)組分損失。為了防止乳化,可應(yīng)用較大體積的有機(jī)溶劑,避免猛烈振搖或加入適當(dāng)?shù)脑噭└淖?gǎibi224。n)其表面張力而破乳,若已發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象,可將試管置于冰箱中冷凍破乳。 萃取過(guò)程中所用的玻璃容器壁對(duì)某些藥物的吸附是不可忽略的,特別是當(dāng)藥物濃度較低時(shí)更是如此。除對(duì)萃取所用的器具進(jìn)行硅烷化處理以外,還常在萃取劑中加入異戊醇。異戊醇能減少玻璃壁的吸附,還可減少萃取過(guò)程中乳化的形成。也可以加入二乙胺,二乙胺能顯著減少吸附作用,提高萃取回收率。,第七十一頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,固相萃取(cu236。qǔ)(SPE),固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)是近十幾年迅速(x249。n s249。)發(fā)展起來(lái)的一種樣品預(yù)處理技術(shù),它是以液相色譜分離機(jī)制為基礎(chǔ)建立起來(lái)的分離和純化方法。 固相分離有兩種實(shí)現(xiàn)樣品純化的途徑。一種是保留雜質(zhì),待測(cè)組分不被保留而自然流出或者被洗脫。更為常用的一種途徑是先使待測(cè)物完全保留在柱上,使干擾雜質(zhì)隨樣品溶劑或洗滌液洗出,然后以小體積溶劑洗脫待測(cè)物。,第七十二頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)：,與經(jīng)典的液液萃取法相比,固相萃取的優(yōu)點(diǎn)有: ①快速,一般l~2min即可完成(w225。n ch233。ng)。 ②回收率高,通常超過(guò)90%。 ③精密度比較好。 ④樣品用量少,有一定的選擇性,無(wú)乳化現(xiàn)象等。,第七十三頁(yè)，共一百二十一頁(yè)。,SPE柱,SPE柱可以是一個(gè)玻璃(或塑料)小柱,裝入適當(dāng)?shù)奶盍?ti225。nli224。o)(固相提取劑),自制的固相萃取柱填充疏松,溶劑能自然流出。 現(xiàn)在已經(jīng)有許多不同形式的商品化固相萃取柱,大多數(shù)商品化柱都是聚丙烯管型柱,底部壓縮裝入100~500mg的填料。 使用時(shí)將液體樣品從柱上口加入,樣液通過(guò)固相萃取柱下端流出,液體樣品通過(guò)柱子時(shí)必須施加外力,可在柱下端出口處減壓,或于柱上口加壓,