【正文】 》實驗指導實驗一 金霉素鏈霉菌培養(yǎng)基的制備（驗證型）實驗目的：學會培養(yǎng)基的配制掌握滅菌方法。實驗原理：金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門(Actinobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，鏈霉菌屬(Streptomyces)。在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生金色色素，故名。其菌落為草帽型, 菌落直徑一般為3～5毫米, 表面較平坦, 中間有隆起。菌落開始為白色，長孢子后變青色。在顯微鏡下可以看到短桿狀的菌絲?？咕毓I(yè)上用以生產(chǎn)金霉素。放線菌是一類介于細菌與真菌之間的單細胞微生物。放線菌在土壤中分布最多，大多數(shù)生活在含水量較低、有機質(zhì)豐富和微堿性的土壤中。多數(shù)情況下，泥土中散發(fā)出的“泥腥味”就是由放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養(yǎng)，菌絲纖細，分枝，常從一個中心向周圍輻射生長。因其生長具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產(chǎn)生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛應用，可產(chǎn)生抗菌素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和分離出的由放線菌產(chǎn)生的抗生素多達4 000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)廣泛地得到應用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾??；有些可生產(chǎn)蛋白酶、葡萄糖異構酶；有的用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌生產(chǎn)或經(jīng)半合成制取的一類廣譜抗生素。抗菌譜極廣，包括革蘭氏陽性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環(huán)素和土霉素。四環(huán)素早在1948年即開始用于臨床，至今已有50余年歷史。現(xiàn)在四環(huán)素已被收入中國藥典2005版，還被收入美國、英國、日本等許多國家的藥典。上世紀70～80年代四環(huán)素產(chǎn)銷處于全盛時期，我國有上百家企業(yè)生產(chǎn)，臨床用量很大。多年來由于四環(huán)素類的廣泛應用，臨床常見病原菌對金霉素耐藥現(xiàn)象嚴重。1950年，國外有報道四環(huán)素族藥物引起牙著色，病因是在牙的發(fā)育礦化期服用四環(huán)素族藥物，可被結合到牙組織內(nèi)，使牙著色。四環(huán)素還可在母體通過胎盤引起乳牙著色。其后又后續(xù)報道四環(huán)素沉積于牙、骨骼以至指甲等，而且還能引起釉質(zhì)發(fā)育不全。在這方面，國內(nèi)直至70年代中期方引起注意。自20世紀80年代后期起，因細菌耐藥性增加以及新的抗生素大量上市等原因，四環(huán)素產(chǎn)銷逐漸萎縮，市場疲軟。因為副作用大，只外用，用于治療結膜炎、沙眼。材料、試劑和器材： 試劑：NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）M促進劑母液（ g／L）器材：1ml移液槍；不銹鋼鍋；電爐；臺秤、天平其它物品：蒸餾水、250ml三角瓶、500ml三角瓶、鑰匙、燒杯、玻璃棒、量筒、紗布、剪刀、棉花塞、報紙、線繩、皮筋、記號筆、1ml移液槍頭、槍頭盒 實驗步驟： 1．種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4，(NH4)2SO4 3，MgSO47H2O ，KH2PO4 。先稱取黃豆餅粉20g，單獨煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布壓榨取汁，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2．定向發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，(NH4)2SO4 3，MgSO47H2O ，α—。配制方法同種子培養(yǎng)基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對四環(huán)素產(chǎn)量的影響：(1)對照(不加其他成分)；(2)加入NaBr母液至終濃度為2g／L；(3)加入KCl母液至終濃度為2g／L；(4)加入NaBr母液至終濃度為2g／／L。每兩組配一套。3．滅菌將封好口的培養(yǎng)基121℃滅菌30min。同時滅1ml 剪口移液槍頭、。（總過程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅菌）注意事項：1．黃豆餅粉煮沸取汁。2．培養(yǎng)基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3．滅菌時鍋內(nèi)要補足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。補充閱讀：工業(yè)發(fā)酵中利用生產(chǎn)菌發(fā)酵得出最終產(chǎn)物是一個逐級放大的過程，各個不同的階段對于營養(yǎng)成分的要求也各有特點，根據(jù)發(fā)酵不同階段的要求，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是：第一，營養(yǎng)不要太豐富（特別是有機氮源），否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長和產(chǎn)孢子，%酵母膏或酪蛋白后，就只長菌絲而不長孢子。第二，所用無機鹽的濃度要適量，不然也會影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因為它們含氮量少，疏松、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯，成為活力強的“種子”。所以種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達到較高的溶解氧，供大量菌體生長繁殖。種 2 子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營養(yǎng)豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺激孢子發(fā)芽。但無機氮源容易利用，有利于菌體迅速生長，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機及無機氮源。最后一級的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應，快速生長。發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。但若因生長和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時，則可考慮培養(yǎng)基用分批補料來加以滿足。