【正文】 the test task 15 days, TestQuest39。s test efficiency than 第13頁 ConclusionsThis paper presents a technique based on embedded intelligent devices Agent test method, which uses embedded intelligent Agent technology equipment is tested in test equipment, test and simulate and control the network environment, a good shielding of the embedded the plexity of smart devices to improve the test efficiency and reusability of the research work, we will further develop the test system so that it can support the whole testing life innovation of the author: This article introduces the software Agent technology to automate testing of embedded intelligent devices, the use of Agent39。s features, nice screen test for embedded smart devices, testers, test device, the plexity of the network environment and increase the efficiency of automated :《 Journal of Electronic Science and Technology》第四篇：專業(yè)英語論文翻譯MET基因復制數量的增加賦予單克隆抵抗體抗MET的能力并且建立藥物依賴性關鍵詞：MET，MVNV30單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，抗性，藥物依賴性 【摘要】：被MEI原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體領導了具體抑制劑的發(fā)展并在癌癥中起很重要的作用，其中現在一些正處于前進的臨床試驗階段就以前的經驗表明對大多數靶向治療最主要的限制是抗性的出現。在對MET單克隆抗體抗性和抗體對化學抑制劑旁路抗性（反之亦然）一無所知時，酪氨酸激酶抑制劑對MET的抗性機制就已經被提出。EBC1型肺癌細胞是MET基因擴增的結果，并且這種細胞對MET抑制劑非常敏感，包括MET單克隆抗體的單機形式在內。我們培養(yǎng)生成抵抗抗體的細胞發(fā)現這種抗性是由于MET基因大量復制擴增和它的受體顯著表達而來。這種過度表達可以使單克隆抗體的“脫落”活動達到飽和，并且能夠防止表面的MET受體的有效的下調和抑制劑的活化作用。值得注意的是MVDN30抗體的抗性細胞是MET耐受細胞對MET酪氨酸激酶抑制劑也很敏感。除此之外，抗體抗性細胞還具有藥物依賴性,MVDN30的去處導致它們死亡是由于它們的過度信號表達。在實驗中，對MET酪氨酸激酶抑制劑存在抗性的細胞仍然對MVDN30抗體的作用敏感。結果表明一種不連續(xù)的通過抗體和化學激酶抑制劑聯合治療可能會使靶向治療的臨床反應和對MET抗體治療旁路的抗性增加?？s略語：MVDN30單價DN30，TKEs—酪氨酸激酶抑制劑，HGF—肝細胞生長因子，MAPK—有絲分裂原活化蛋白激酶 可以抑制一個特定的目標分子化合物的靶向治療法開辟了治療癌癥的新道路。與主要殺死擴散細胞為主的傳統(tǒng)化療不同的是靶向藥物對腫瘤細胞采取一種更具體的治療方式。靶向治療依賴于“癌基因沉癮”的概念。這就意味著單個基因的抑制或死亡是由于它們的沉癮，或者至少抑制它們的生長（溫斯坦,2002）。臨床試驗中的特定抑制劑的發(fā)展給腫瘤細胞的“Achille’s heel”的識別提供支持（溫斯坦和喬，2006）。盡管靶向治療在一部分癌癥患者中取得了較優(yōu)異的效果，還有重要的一點就是部分癌癥病人對藥物的選擇表達沒有起到治療作用（原發(fā)性），除此之外，幾乎總是一開始患者反應變成后來對治療的抵抗和復發(fā)（繼發(fā)性）。因此，最關鍵的就是要發(fā)現對治療抵抗的機制并且找到繞過它們的方法。癌基因和人類癌癥密切相關，酪氨酸激酶起著決定性作用。這個觀察發(fā)現許多腫瘤沉溺其中使得蛋白激酶成為了治療癌癥的理想目標（巴塞爾加，2006。Gschwind等人，2004）。在臨床診斷中主要使用一種較小的激酶抑制劑和單克隆抗體來抑制酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制劑是一種可以抑制靶蛋白酶活性的小分子物質。它們能有效地瞄準膜結合位點和細胞內的激酶并且很容易在體內擴散。單克隆抗體已被廣泛用于臨床并取得了可觀的成果。這些分子的優(yōu)點在于它們具有很高的特異性。在癌癥治療中的可以抗癌的RTKs單克隆抗體已經被批準在乳腺癌和結腸癌中使用(分別針對HER2和表皮生長因子受體)并可作為抗血管增生的藥物（針對血管內皮生長因子受體）。除此之外，很多針對于其他目標的單克隆抗體正處與發(fā)展和試驗階段。最近，一種作為癌癥治療目標的RTK受到關注，這種RTK是由致癌基因編碼的在肝細胞生長因子上的酪氨酸激酶受體。在和肝細胞生長因子結合后，MET活化并啟動一個復雜的生化程序，這個過程被稱作“浸潤性上長”。在腫瘤組織中，浸潤性生長的增進可以迫使腫瘤細胞從腫瘤組織中分解下來侵蝕基底膜，滲入基質中，甚至定居于新的組織中來實現轉移。很多研究結果表明MET在人類的許多腫瘤中具有活性，并且它與對直接激酶療法的持續(xù)抗性密切相關。除此之外，還表明細胞顯示大量復制（超過8張）和隨之而來的過度表達和獨立配體的激活都是沉溺于這種致癌基因和抗MET藥物的應答中。在前期設置得到的基本結果，幾種特定的多目標的酪氨酸激酶抑制劑和直接針對于MET或者HGF的抗體已經進入了臨床試驗階段。在活體和動物模型進行的研究已經表明用TKIs長期治療會導致機體的治療耐受性。對MET TKIs的抗性可能是由于一些機制，比如MET基因擴增，過度表達，MET點突變，MET平行路徑的激活和KRAS基因的擴增機制。然而，關于對MET的單克隆抗體的再次具有抗性一無所知。我們以前報道過主要針對細胞外的部分MET的抑制性單克隆抗體的研究進展。它的誘導、再結合、達到MET脫落閾值的能力使其有抑制活性，剩余的跨膜片段通過蛋白酶體降解途徑處理掉。因此，DN30結合到MET后的結果是使其變成可溶性的誘餌MET并且蛋白水解酶會講解MET激酶。這促進了MET介導的生物活性的抑制作用。設計了這樣一個過程就是因為DN30的結合使得MET激酶部分活化并且導致抗體介導的受體同源二聚體化和單價Fab片段失去競爭活性的一個過程。在這個研究中我們表明了不斷用MVDN30來治療沉癮癌細胞會使其具有抗性的原因是MET基因的大量復制和MET的過度表達超過了MVDN30對其有效下調并使其失去活性的的能力。值得注意的是，MVDN30抗性細胞還會一直對MET TKIs產生耐受性和敏感性。有趣的是，它們獲得了藥物耐受性，當受到MVDN30的驅除致死它們的是過多的信號表達。我們還表明對MET TKIs 有抗性的細胞也對MVDN30敏感，所以，MVDN30和MET TKIs 對腫瘤細胞的作用是相互促進的。 EBC1 細胞從一個患有轉移皮膚腫瘤的病人取得，這個患者還患有肺鱗狀細胞癌，病例是從日本癌癥資料庫購買得到。GTL16 是一種實驗室里的克隆胃癌細胞系。HEK293T細胞系分離于人類胚胎時期的腎，A549細胞系來源于肺癌，都是從ATCC購買來培養(yǎng)的。對MVDN30有抗性的EBC1細胞可以通過一個逐步的方法培養(yǎng)得到，由Sigma Tau Ramp。D 提供的通過暴露親代細胞方法來增加抗MET單價單克隆抗體的濃度。親代細胞用10 mg/ml 的MVDN30治療約一個月，直到生成的R10細胞開始產生抗性為止，R10抗性細胞又用逐步增加濃度的MVDN30治療。所有的抗體耐受細胞培養(yǎng)在存在MVDN30并且可以使它們產生耐受性的條件下。大約兩個月可以分離到R20抗體抗性細胞，四個月可以分離到R80抗體耐受細胞。EBC1 and GTL16 細胞對MET TKIs PHA665752(EBC1 RPHA 50 nM and GTL16 RPHA 150 nM)都有耐受性，并且向描述的那樣培養(yǎng)可以一直保持PHA665752的存在。該細胞系的遺傳身份通過一個短的串珠狀重復序列（STR）識別，這段序列在2013年7月再次重復出現。We 我們利用下面的小分子：ATP競爭行MET TKIs PHA665752(Tocris Bioscience)and JNJ38877605(Johnson amp。 Johnson)和p38MAP激酶抑制劑SB203580(Merck).用Trizol 試劑提取得到的RNA被檢測到利用多文士病毒的逆轉錄酶和隨機引物合成，cDNA可以用實時的利用電源帶動的綠色PCR混合的PCR 技術來實現擴增，根據制造商的說明下面的MET和ACTIN特異性引物要用到： hMET ex 19 Fw: 50AGTTTACCACCAAGTCAGATGTGT30。hMET ex 20 Rw: 50GGGCTCCTCTTGTCATCAGC3。hACTIN Fw: 50GGAGGAGCTGGAAGCAGCC30。hACTIN Rw: ，這種技術是用 TaqMan基因表達的主要結構和TaqMan探針MET基因和RNaseP控制基因的實時定量PCR分析。MET的mRNA的成倍增加和EBC1中MET基因的大量復制以及MVDN30抗性細胞歸一化然后被認可。蛋白提取液(40 mg), 細胞上清液(20 ml)。在細胞裂解前2小時把MET TKI JNJ38877605加入到指定的地方。免疫印跡法使用了以下的初級抗體：the antiMET Intracellular domain(ICD)(zymed, 370100)from Invitrogen, antiMET ECD(DL21)obtained as described(Prat et al., 1991), antiphosphoTyr1234Tyr 1235MET(3126), antiAKT(9272), antiphosphoSer473AKT(4060),antip44/42MAPK(9102),antiphosphoThr202Tyr204p44/42MAPK9101),antip38MAPK(8690),antiphosphoThr180Tyr182p38 MAPK(9215), from CellSignaling。antivinculin(V9131)from Sigma and antibactin(I19 sc1616)from Santa Cruz IgG HRPPeroxidase antibodies were from ，或MVDN30抗性的EBC1細胞(R80)都被平鋪在60mm的盤里。R80 細胞保存在有或沒有抗體（80 mg/ml）存在的條件下，而WT細胞要一直保存在有抗體的條件小16小時。然后，這些細胞在不含L蛋氨酸但有500mmMCIL甲硫氨酸S35(脈沖)（易標記）的DMEM培養(yǎng)基中處理20分鐘。在這之后，去處放射性標記的培養(yǎng)基，細胞用1ml磷酸鹽緩沖液鹽水洗兩次然后保存在有2mlISCOVE的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入2%FBS，在MVDN30(80 mg/ml)。之后，用免疫沉淀法（IP）在1ml細胞裂解液中進行測定（裂解緩沖液：1% TritonX100存在下，20 mM Tris鹽酸，5毫米EDTA，10% V / v甘油，150 mM NaCl補充蛋白磷酸酶抑制劑）通過使用抗Met ICD dq13單克隆抗體，而IP法利用抗Met ECD do24單克隆抗體對細胞培養(yǎng)2毫升上清液進行。細胞裂解液和上清液都在有已知抗體的培養(yǎng)基里培養(yǎng)16個小時，抗鼠IgG抗體預包被瓊脂糖凝膠蛋白珠形成免疫復合物沉淀下來。免疫沉淀物中的蛋白就會被8% SDSPAGE 分開，然后轉移到3mm的紙上，80度，48小時后蛋白質的放射性就會在投影膜上留下印記。用于細胞生長和可行性分析的這些細胞被接種在96孔的培養(yǎng)板上，根據制造商的說明用已知藥物在不同時期進行處理然后用細胞滴度發(fā)光細胞進行可行性分析。沒經過處理的細胞控制在藥物載體存在的條件下生長。所有的數據進行歸一化到0天的藥物治療。對結合在EBC1WT,R20,R80細胞質膜上的MET進行免疫熒光著色，這些細胞要提前在有或沒有MVDN30存在的條件下培養(yǎng)24小時。熒光性的強度可以通過細胞熒光性分析檢測到。用于檢測的細胞要在PBS中用2%FBS洗滌并且在室溫下用抗MET ECD DO24 mAb(100 ng/ml)著色20分鐘。然后在室溫下細胞又在PBS中用2%FBS洗滌就會逐步產生抗鼠IgGRPE二抗然后用二脒基苯基吲哚作用20分鐘。作為陰性對照，將不含初級抗MET抗體的細胞進行染色。質膜結合的蛋氨酸的熒光強度（AU為單位），通過使用GraphPad Prism軟件繪制為箱形繪圖圖表。EBC1 WT 細胞能穩(wěn)定地在兩種不同量的慢性病毒顆粒編碼的MET cDN轉導，包括1mg(MET254。254。)(MET254。254。254。)的p24病毒抗原，其濃度按說明確定。作為對照，WT細胞用含有空載體病毒顆粒感染。MVDN30抗性細胞(R20 and R80)只用空載體感染。在感染48小時后接種細胞用于生物化學分析。轉導細胞的可行性分析如先前描述的一樣進行，讓細胞在存在或不存在MVDN30的條件下上長72小時。如先前所述，MET的蛋白印跡分析和磷酸化的MET蛋白水平和對感染細胞的mRNA的表達水平實時定量PCR分析一樣子細胞感染72小時后進行評估。在抗MET抗體MVDN30和MET TKI JNJ38877605之間進行藥物協(xié)同作用分析是對WT EBC1和接種在96孔板上的G