【導(dǎo)讀】王軍.離子液體的性能及應(yīng)用.中國(guó)紡織出版社.張鎖江,呂興梅等.離子液體—從基礎(chǔ)研究到工業(yè)應(yīng)用.科學(xué)出版社.官斌，孟慶偉，高占先.有機(jī)催化的不對(duì)稱反應(yīng).（論文）任務(wù)書于年月日發(fā)出，應(yīng)于年月日前完成，然后提交畢業(yè)考試委員會(huì)進(jìn)行答辯。機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。而離子液體作為一種新型的反應(yīng)介質(zhì)由于其具非揮。發(fā)性、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性好等的特點(diǎn)而被譽(yù)稱為21世紀(jì)的“綠色反應(yīng)劑”。的廣泛應(yīng)用可以很好的解決環(huán)境污染問題。近年來，離子液體被廣泛關(guān)注，其在各方。由于離子液體作為一種高效的溶劑和共溶劑在生物催化合成手性物質(zhì)中發(fā)揮著重。研究結(jié)果表明，當(dāng)pH為，底物濃度為10mM，過氧化氫添加量為。6mM，且過氧化氫分5次添加時(shí)底物轉(zhuǎn)化率和。在幾種有機(jī)溶劑反應(yīng)體系。中，異丙醇的底物轉(zhuǎn)化率和，達(dá)到60%和91%。在所研究的親水性和疏水

　　

【正文】 加 5 次 。反應(yīng) 20 分鐘后往各個(gè) 樣（ 200μL）中分別 添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 緩沖溶液）讓酶失活，再用 乙醚萃取，然后取 20μl上清液作 HPLC 分析。 過氧化氫分批不同量添加對(duì)酶促不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 再取 500ul氧化反應(yīng)體系中含： 苯甲基硫醚溶液（溶解于 異丙醇 ） ， 2mg/ml辣根過氧化物酶溶液， 適量 過氧化氫 （ 1mM、 2mM、 3mM、 4mM、 6mM、 8mM、 10mM、20mM）。 反應(yīng) 在 28℃ 恒溫 水浴鍋中進(jìn)行，從第一次添加 H2O2 溶液開始計(jì)時(shí)，分批添加若干次，每次加 5μL，每次時(shí)間間隔 1 分鐘。反應(yīng) 20 分鐘后往各個(gè) 樣 （ 200μL）中分別 添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 ）讓酶失活，再用 乙醚萃取，然后取 20μl 上清液作 HPLC 分析 。 在 4 個(gè) 2ml具塞離心管中分別加入 1ml反應(yīng)液 {}，包括適量苯甲硫醚 {1mM、10mM、 20mM、 40mM }、 1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和 10%異丙醇｛ V/V｝，混合均勻后，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)（ 28℃、 180 r/min），反應(yīng) 20 分鐘后分 別取樣 200μL，添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 液）讓酶失活，再用 乙醚萃取，最后取 20μl 上清作 HPLC 分析。 、 13 苯甲硫醚標(biāo)準(zhǔn)曲線051015200 1 濃度（m M ）峰面積（AU*S） 圖 為不對(duì)稱氧化反應(yīng)底物苯甲硫醚的標(biāo)準(zhǔn)曲線 其回歸方程為 y = + 底物轉(zhuǎn)化率（ %）＝（反應(yīng)前底物濃度 反應(yīng)后底物濃度） /反應(yīng)前底物濃度 100% ％＝ [(SR )/(S+ R )] 100％ 用高效液相色譜檢測(cè)反應(yīng)體系中苯甲硫醚、 R苯甲亞砜、 S苯甲亞砜的濃度，分析條件如下： 儀器：高效液相色譜（ HPLC） LC2100， FID 檢測(cè)器， 美國(guó) Agilient 公司； 流動(dòng)相：異丙醇 /正已烷 (15/85,v/v)；流速： ml/min；柱溫： 30℃；進(jìn)樣量： 20μL ；手性色譜柱： Chiralcel ODH（ 15cm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 242 nm。苯甲硫醚、 R苯甲亞砜、 S苯甲亞砜的保留時(shí)間分別為： min、 min 和 ；采用外標(biāo)法，條件穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，平均誤差不超過 %。色譜圖見附錄 。 結(jié)果與討論 不對(duì)稱氧化反應(yīng)條件的確定 酶含量對(duì)酶促不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 14 e . e . s 值S 亞砜的產(chǎn)量051015202530354045 1 2酶量 ( m g / m l )e.e.s值( %)012345678S亞砜的產(chǎn)量 (μm) 圖 為酶含量對(duì) S型產(chǎn)物產(chǎn)量 和 的影響 Fig Effect of enzyme on sulfoxidation 通過對(duì) S型產(chǎn)物產(chǎn)量和 ，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，酶加的越多，產(chǎn)物的產(chǎn)量也越大，但是當(dāng)酶含量越過一定范圍時(shí)，產(chǎn)物的 ， 雖然產(chǎn)量在圖中并沒有很大 的變化 ，但 純酶價(jià)格昂貴，故要嚴(yán)格控制酶的添加量，每毫摩爾底物加入 ～ 2mg/250ul 酶粉 為宜。 過氧 化氫含量對(duì)酶促不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 e . e . s 值S 亞砜產(chǎn)量0510152025303540452 4 6 8過氧化氫 ( m M )e.e值 (%)012345678S亞砜的產(chǎn)量 (μm) 圖 H2O2 含量 對(duì) S型產(chǎn)物產(chǎn)量 和 的影響 Fig Effect of H2O2 on sulfoxidation 從圖中看出前期隨著過氧化氫加入量的增多， ，但過氧化氫加入量超過一定的程度， ，這是 由于過量的過氧化物氧化劑會(huì)將手性亞砜進(jìn)一步氧化成砜，故應(yīng)把 H2O2 的含量控制在一定濃度下，從產(chǎn)物產(chǎn)量與對(duì)映體過量值綜合考慮， 控制 H2O2 為 6 mM 為 宜 。 15 pH 對(duì)酶促不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 e . e . s 值S 亞砜產(chǎn)量051015202530354045 7 p H 值e.e值 (%)0123456S亞砜的產(chǎn)量 (μm) 圖 pH 值 對(duì) S型產(chǎn)物產(chǎn)量 和 的影響 Fig Effect of PH on sulfoxidation 通過極差分析，可能清楚的看出 pH 值對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物 ，僅次于酶量對(duì)反應(yīng)的影響，在一定 pH 值范圍內(nèi)，產(chǎn)物 pH 值的升高而下降。然而 pH 值對(duì)反應(yīng)產(chǎn)量的正面影響是先升后降。綜上所述，此氧化反應(yīng)的最適 pH 值為。 過氧化氫的添加方式對(duì) 酶促 不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 過氧化氫等量 不同次數(shù)添加對(duì)酶促不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 底物轉(zhuǎn)化率（ % ）e . e 值（ % ）0102030405060701 2 3 4 5氧化劑添加次數(shù)e.e.值(%)74757677787980底物轉(zhuǎn)化率(%) 圖 等量過氧化氫分不同次數(shù)添加對(duì)不對(duì)稱氧化的影響 Fig. Effect of H2O2 adding style at stable concentration on sulfoxidation 在 6mM 濃度下進(jìn)行， 隨氧化劑添加次數(shù)的增多而增大，而轉(zhuǎn)化率反之 。同量的過氧化氫，一次性的加入，過氧化氫會(huì)把部份的酶鈍化而使其失活，所以 都會(huì) 有所下降 。如果分批不同次數(shù)的加入過氧化氫，過氧化氫不會(huì)使酶失活，可以很 16 好地使 酶 變成另外的一種構(gòu)型催 化磺化反應(yīng)的進(jìn)行，所以此時(shí)的 更 好的體現(xiàn) ，而且是隨著加入的次數(shù)的增多， ， 但 產(chǎn) 物的轉(zhuǎn)化率卻下降了，這是由于分批加入的過氧化氫 使酶的利用率提高，而氧化劑自發(fā)的氧化作用減弱。 把部分的產(chǎn)物徹底 氧化成了其它物質(zhì)（砜）等。 所以 為了得到更高的選擇性等綜合因素的考慮，在反應(yīng)中應(yīng)該采取分批次地加入過氧化氫的方法。 過氧化氫分批不同量添加對(duì)酶促不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 .(%)SubstrateConversion(%)30354045505560650 5 10 15 20 25H2O2 Content(%).(%)919293949596Substrate Conversion(%) 圖 過氧化氫分批不同量添加對(duì)酶促不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 Fig Effect of H2O2 adding style at the changable concentration on sulfoxidation 用 1mM、 2mM、 3mM、 4mM、 6mM、 8mM、 10mM、 20mM 的 H2O2 在反應(yīng)體系中作氧化劑反應(yīng)。 在 1mM～ 6mM 氧化劑之間， . 值隨氧化劑含量的增加而逐漸增大， 在 6mM～ 20mM 氧化劑之間 ，而底物轉(zhuǎn)化率隨氧化劑增加緩慢增大。 底物濃度對(duì)酶促芳香基硫醚不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 606 0 . 16 0 . 26 0 . 36 0 . 46 0 . 56 0 . 66 0 . 76 0 . 86 0 . 9611mM 10mM 20mM 40mMS u b s t r a t e c o n t e n t ( m M )e.e.s(%)888990919293949596Conversion(%) 17 圖 底物濃度對(duì)酶促硫醚不對(duì)稱氧化反應(yīng)的影響 Fig Effect of substrate concentration on sulfoxidation 從圖中可以看出，底物濃度從 1mM 到 40mM 的過程， 底物濃度對(duì) 有 影響 ，但并不是表現(xiàn)得很明顯 ， 這可能與 HRP 酶本身的特性有關(guān)。 轉(zhuǎn)化率在后期有所提高，但變化也不大，因?yàn)樵?1mM 時(shí)產(chǎn)率為 91%，但底物濃度提高到 40mM 時(shí)，產(chǎn)量轉(zhuǎn)化率為 95% 。 說明了酶對(duì)反應(yīng)底物的催化反應(yīng)有一定的限度，這可能后期的時(shí)候酶受到了過氧化氫或溶劑等物質(zhì)的破壞，使酶部份的 鈍化了或失活了 ，無有能力繼續(xù)進(jìn)行催化 底物 反應(yīng)。 考慮到 值和產(chǎn)量因素，底物濃度選在 10mM 為宜。 結(jié)論與展望 在 不對(duì)稱反應(yīng) 中，反應(yīng)的影響因素 有很 多 ，包括 反應(yīng)體系的 pH、底物濃度、酶的添加量、過氧化氫的添加量和添加方式等。 pH 對(duì)反應(yīng)的影響特別明顯， pH 的過高或過低對(duì)反應(yīng)都非常的不利，應(yīng)該通過重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)來確定最佳的反應(yīng)體系 pH 值，本實(shí)驗(yàn)最佳的 pH 是 。 在得到最佳的 pH 值后，應(yīng)該采取一定的措施保持反應(yīng)體系 PH 的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)采用磷酸緩沖液體系來保持體系 pH 的穩(wěn)定性。 底物濃度對(duì)反應(yīng)的 影響也很大，對(duì)轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生一定的影響，底物濃度增大，轉(zhuǎn)化率會(huì)有一定的提高，但也不是很明顯，實(shí)驗(yàn)中底物從 1mM 提高到 40mM 時(shí)，轉(zhuǎn)化率提高了 5 個(gè)百分點(diǎn)左右。但底物濃度對(duì)產(chǎn)物的 ，從 1mM 提高到 40mM 的過程中幾乎沒有變化。 綜合考慮 值和產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)底物濃度選在10mM。 酶的添加量對(duì)越多，后期 ，加上酶的價(jià)格過高，加入過多的酶對(duì)不符合經(jīng)濟(jì)要求， 也對(duì)反應(yīng)沒利，應(yīng)該嚴(yán)格控制酶量的添加， 在實(shí)驗(yàn)中酶的添加量 mM 為宜。 過氧化氫對(duì)反應(yīng)的影響是很明顯也是很直接的，一次性地加 入過氧化氫，過量的過氧化氫會(huì)使酶總份地失活，從而導(dǎo)致反應(yīng)率的下 降，分批多次的加入過氧化氫的方法可以很好的解決這個(gè)問題。 同量的過氧化氫分開加入的次數(shù)越多， .值越高，但轉(zhuǎn)化率有一定的下降，是因?yàn)槊恳淮渭尤氲倪^氧化氫都會(huì)把一定的產(chǎn)物亞砜氧化成砜。 本實(shí)驗(yàn)中過氧化氫的添加量為 6mM，分開五次加到反應(yīng)體系中。 在這里雖然對(duì)反應(yīng)的規(guī)律作了一些初步的探索，但當(dāng)中也有一些問題沒能得到很好的解決， 比如 ，還有現(xiàn)在 反應(yīng)反用的 酶價(jià)格過貴，對(duì) 反應(yīng) 作進(jìn)一步探索也有一定的經(jīng)濟(jì)阻力。希望可以有更廉價(jià)的酶對(duì)反應(yīng) 可以起作用，這有利于開展 更多量的實(shí)驗(yàn)研究。 18 第三 章 有機(jī)溶劑中 HRP 促甲基苯 基硫醚不對(duì)稱氧化反應(yīng)的研究 實(shí)驗(yàn)材料 （ 同 ） （ 同前 ） 、 （ 同前 ） （ 同前 ） 實(shí)驗(yàn)方法 一般來說， logp 值介于 0～ 3 的溶劑不宜作為酶催化反應(yīng)的非水介質(zhì)溶劑。只有在少數(shù)情況下，對(duì)強(qiáng)極性底物如多羥基化合物才考慮采用中等極性或與水互溶性溶劑如四氫呋喃等，在這些溶劑中，除 極少數(shù)特別穩(wěn)定的酶如枯草桿菌蛋白酶外，絕大多數(shù)酶都會(huì)失活。醇類的 logp 范圍為 ～ 0，用于親脂性底物反應(yīng)，其含量為 1%～50%時(shí)，不影響酶的活性。 故選甲醇（ logp=）、乙醇（ logp=）、異丙醇（ logp=）作為本反應(yīng)的有機(jī)溶劑。 在 6 個(gè) 2ml 具塞離心管中分別加入 1ml 反應(yīng)液 {}，包括 2mM 苯甲硫醚、1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和 10 %有機(jī)溶劑｛ 甲醛、 甲醇、乙醇、異丙醇 、乙腈、丙酮 ｝， 混合均勻后，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)（ 28℃、 180 r/min），定時(shí)分 別取樣 200μL，添加 20μL的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 鹽緩沖溶液）讓酶失活，再 于通風(fēng)櫥中 用 乙醚萃取，然后取 20μl 作 HPLC 分析。 pH 值的影響 取 6 個(gè) 10ml 離心管 ,加入 4ml 反應(yīng)液 {}，包括 2mM 苯甲硫醚、 1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和適量有機(jī)溶劑｛ 1%、 5%、 10%、 20%、 40%、 80%， V/V｝，混合均 勻后， 用 pH 計(jì)分別測(cè) pH 值。 不同配比 異丙醇 /水混合相中的酶促芳香基硫醚不對(duì)稱氧化反應(yīng) 在 6個(gè) 2ml 具塞離心管中分別加入 1ml 反應(yīng)液 {}，包括 2mM 苯甲硫醚、 19 1mg/ml 辣根過氧化物酶、 3mM H2O2 和適量有機(jī)溶劑｛ 1%、 5%、 10%、 20%、 40%、 80%，V/V｝，混合均勻后，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)（ 28℃、 180 r/min），定時(shí)分 別取樣200μL，添加 20μL 的 Na2SO3（ 1mol/L, 溶解于 pH= 的 液）讓酶失活， 再 于通風(fēng)櫥 中 用 乙醚萃取，然后取 20μl 作 HPLC 分析。 結(jié)果與討