【正文】 。第八十八 頁 ，共一百二十三 頁 。構(gòu)建改形抗體的一般性原那么1. VH和 VL的序列均應(yīng)盡可能選自人的同一種 Ig，以減少兩條鏈裝配的不親和性。2. 在選用人的 Ig序列時，應(yīng)選用其可變區(qū)氨基酸序列與鼠源 McAb可變區(qū)氨基酸序列同源性最大的 Ig，以盡量減少 McAb的 CDR插入人的 FR時影響 CDR的構(gòu)象。3. 用計算機構(gòu)建鼠源 McAb的分子模型，可以發(fā)現(xiàn) FR中有一些氨基酸殘基與 CDR靠得很近，有可能影響 CDR構(gòu)象。還有一些 FR的氨基酸殘基直接與抗原接觸。如果這氨基酸殘基在人、鼠間不同，那么一致改為鼠的殘基。第八十九 頁 ，共一百二十三 頁 。4. 所選用的人 Ig可變區(qū)中含有一些不常用的氨基酸殘基，在改形抗體中那么改為 Ig通用的殘基。 5. 有些 FR序列在進化上具有高度保守性，人、鼠 Ig之間輕鏈 FR FR和 FR4，重鏈的 FR FR和 FR4都有完全相同的序列。輕鏈 FR1中有一種序列只有一個殘基不同，重鏈 FR3中有一種序列只有兩個殘基不一致。利用這些序列不僅可能使抗原性降到最低限度，而且可能保持原抗體的親和性。6. 為提高抗體的親和性，可以把 CDR中與抗原外表最靠近的帶靜電的殘基換成不帶電的親水殘基，從而使抗體與抗原之間更緊密地結(jié)合。 第九十 頁 ，共一百二十三 頁 。小分子抗體n Fabn 單鏈抗體n 單域抗體n 最小結(jié)合單位第九十一 頁 ，共一百二十三 頁 。〔 1〕 Fab 由重鏈 VH加 CH1及完整的輕鏈構(gòu)成，大小為完整抗體的 1/3。第九十二 頁 ，共一百二十三 頁 。木瓜蛋白酶水解第九十三 頁 ，共一百二十三 頁 。第九十四 頁 ，共一百二十三 頁 ?！?2〕單鏈抗體 (scFv)抗體可變區(qū)的重鏈和輕鏈〔 VH和 VL〕通過連接肽〔約 1525個氨基酸〕連接而成的重組蛋白，即 VHLinkerVL。它是抗體與抗原結(jié)合的最小單位，其分子大小僅為完整抗體的 1/6。 第九十五 頁 ，共一百二十三 頁 。完整抗體 scFv第九十六 頁 ，共一百二十三 頁 。特點① 具有與原親本抗體相同的特異性；② 分子量小，可迅速滲透至腫瘤內(nèi)部或其他靶組織；③ 防止了 Fc段引起的非特異性細胞毒性及免疫原性；④ 制備流程簡單。第九十七 頁 ，共一百二十三 頁 。第九十八 頁 ，共一百二十三 頁 。小分子抗體的主要應(yīng)用領(lǐng)域n 靶向載體n 構(gòu)建其它工程抗體n 細胞內(nèi)抗體 (intrabody)：將小分子抗體基因?qū)爰毎麅?nèi)，使其在細胞內(nèi)特定部位表達，通過與靶抗原的結(jié)合影響其生物學(xué)活性。第九十九 頁 ，共一百二十三 頁 。雙特異抗體 它有兩個抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位，其中一個臂可與靶細胞外表抗原結(jié)合，另一個臂那么可與效應(yīng)物〔如藥物、效應(yīng)細胞等〕結(jié)合，從而將效應(yīng)物直接導(dǎo)向靶組織細胞。 第一百 頁 ，共一百二十三 頁 ?；瘜W(xué)交聯(lián) BsAb分別別離純化兩種不同的 McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后別離出目的組分。此法缺點是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。第一百零一 頁 ，共一百二十三 頁 。細胞工程 BsAb 將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤 (quadroma)。但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。 BsAb在其中的比例可為 10%～ 50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩(wěn)定性差， BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費時費力，臨床應(yīng)用時存在人抗鼠抗體免疫反響 (HAMA)，因此不適用于臨床。第一百零二 頁 ，共一百二十三 頁 ?；蚬こ?BsAb 多采用抗體分子片段 ,如 Fab， Fv或 ScFv,經(jīng)基因操作修飾后 ,或體外組裝為 BsAb,或直接表達分泌型的 BsAb。第一百零三 頁 ，共一百二十三 頁 。微型雙特異性抗體 diabody 它是將同一抗體的 VH和 VL區(qū)分布在不同的肽鏈上，構(gòu)成兩種交聯(lián)的 ScFv，即 VLALinkerVHB和 VLBLinkerVHA。每條獨立的 ScFv鏈均不具備結(jié)合抗原的活性，而它們從大腸桿菌共分泌后形成的異二聚體，那么可同時識別并結(jié)合兩種特異性抗原。由于它具有這種雙特異性，因此在應(yīng)用上有更大的優(yōu)越性。第一百零四 頁 ，共一百二十三 頁 ?？贵w融合蛋白一類是將 Fv段與其他生物活性蛋白如毒素、酶等結(jié)合，利用抗體的特異性識別功能將某些生物活性物質(zhì)引導(dǎo)到特定部位。 另一類是含 Fc段的抗體融合蛋白，它是利用 Fc段所特有的生物學(xué)功能與某些有黏附或結(jié)合功能的蛋白融合而成。 第一百零五 頁 ，共一百二十三 頁 。噬菌體抗體 利用基因工程的方法將全套人抗體重鏈和輕鏈 V區(qū)基因克隆出來，通過噬菌體外表呈現(xiàn)技術(shù)，將抗體分子 Fab段或 scFv段表達在噬菌體膜外表，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體，即噬菌體抗體。這種技術(shù)稱為噬菌體抗體庫(phage antibody library)技術(shù)。所構(gòu)建的抗體庫稱為全套抗體庫 (repertoire antibody)或組合抗體庫(binatorial antibody library)。第一百零六 頁 ，共一百二十三 頁 。 根本原理 該技術(shù)以噬菌體為載體，將抗體基因 (Fab或 scFv基因等 )與噬菌體編碼的外殼蛋白 Ⅲ (CPⅢ )或 Ⅷ 〔 CPⅧ 〕相連，在噬菌體外表以抗體－外殼蛋白融合蛋白的形式表達，經(jīng)輔助病毒感染后，借助 CPⅢ 的信號肽穿膜作用，進入宿主外周基質(zhì)，在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部，隨著攜帶有表達載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體的噬菌體。這種噬菌體抗體可以特異識別抗原，又能感染宿主進行再擴增。因此可以采用類似于親和層析原理從噬菌體抗體庫中篩選出特異性抗體。第一百零七 頁 ，共一百二十三 頁 。構(gòu)建噬菌體抗體庫n 從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中別離 B淋巴細胞，提取 mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；n 應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過 PCR技術(shù)擴增不同的 Ig基因片段；n 構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有 λ 噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建外表表達的噬菌體抗體庫(surface display antibody library)常用載體；n 表達載體轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附 洗脫 擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。第一百零八 頁 ，共一百二十三 頁 。根本原理 :第一百零九 頁 ，共一百二十三 頁 。主要特點 ：n 基因型和表型相統(tǒng)一n 選擇能力和再擴增能力相結(jié)合融合蛋白PIII基因型 表達型第一百一十 頁 ，共一百二十三 頁 。第一百一十一 頁 ，共一百二十三 頁 。優(yōu)點抗體文庫可以到達或超過 1011庫容 ,能包含 B細胞全部克隆建庫的外源基因來自人體多克隆細胞的總 mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的 VH和 VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性方法簡單易行，節(jié)省時間?？赏ㄟ^發(fā)酵生產(chǎn)、大量制備?？贵w庫的大容量抗體庫極高的篩選效率3. 可獲得高親和力的人源化抗體VH和 VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程所用的抗體基因又來自人體 第一百一十二 頁 ，共一百二十三 頁 。四、抗體的應(yīng)用第一百一十三 頁 ，共一百二十三 頁 ?！惨弧逞芯抗ぞ? 單抗只與抗原分子上某一個決定簇相結(jié)合，作為探針可從分子、細胞和器官的不同水平上研究各種抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 抗體是親和層析中重要的配體。將抗體吸附在一個惰性的固相基質(zhì)上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時，待別離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或 pH，欲別離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。 第一百一十四 頁 ，共一百二十三 頁 ?！捕吃\斷試劑、抗體的檢測、酶、藥物等生物活性物質(zhì)第一百一十五 頁 ，共一百二十三 頁 ?！踩持委熀皖A(yù)防第一百一十六 頁 ，共一百二十三 頁 。抗體性藥物主要用途 1．器官移植排斥反響的逆轉(zhuǎn)；2．腫瘤免疫診斷；3．腫瘤免疫顯像；4．腫瘤導(dǎo)向治療；5．哮喘、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿 毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他自身免疫性疾??；6．抗獨特型抗體作為分子瘤苗治療腫瘤；7．多功能抗體〔雙特異抗體、三特異抗體、抗體細胞因子融合 蛋白、抗體酶等〕的特殊用途。第一百一十七 頁 ，共一百二十三 頁 。n 根據(jù)美國藥物研究和生產(chǎn)者協(xié)會〔 PhRMA〕的調(diào)查報告，癌癥是威脅人類健康的主要疾病之一，預(yù)防和治療癌癥是研究和開發(fā)抗體藥物的主要目標(biāo)之一。n 最初抗體主要被用于腫瘤體外免疫診斷和體內(nèi)免疫顯像，隨著抗體工程技術(shù)的不斷進步，近年來人們將更多的目光集中在治療腫瘤的抗體藥物開發(fā)上。n 第一個被美國批準(zhǔn)用于人腫瘤治療的基因工程抗體－ Rituxan〔 r〕最初被用于非何杰金氏淋巴瘤，總有效率達 60％，現(xiàn)在正在探索用于治療艾滋病相關(guān)淋巴瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。第一百一十八 頁 ，共一百二十三 頁 。n 目前在臨床中使用的腫瘤治療藥物多數(shù)存在 “ 敵我不分〞的問題，即在殺死腫瘤細胞的同時，也破壞了人體正常細胞。n “ 生物導(dǎo)彈〞為解決這個難題提供了一個理想的思路。 “ 生物導(dǎo)彈〞，即將各種毒素、放射性同位素、化療藥物與識別腫瘤特異抗原或偶聯(lián)腫瘤相關(guān)的抗原后，能夠特異殺傷腫瘤細胞的一類藥物。n 這種藥物經(jīng)由靜脈注入人體內(nèi)，藥效分子集中作用于腫瘤細胞，既增強療效又減少對機體的毒副作用。放射性同位素與抗體的偶聯(lián)物在體內(nèi)能將前者運至藥靶部位，并通過其放射性活性殺傷靶細胞，還可通過 X射線照相機拍攝核素放射線圖像，用于體內(nèi)治療和定位診斷。第一百一十九 頁 ，共一百二十三 頁 。n 抗體與化療藥物分子的的交聯(lián)物，又稱免疫交聯(lián)物(immunoconjugate)。n 用以制備這類導(dǎo)向藥物的抗癌藥物主要有阿霉素〔adriamycin〕、氨甲蝶呤〔 MTX〕等。n 這些偶聯(lián)物對結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、腎癌、卵巢癌、宮頸癌、乳癌、肺癌、骨肉瘤等有一定的抗癌效應(yīng)。第一百二十 頁 ，共一百二十三 頁 。n 抗腫瘤血管生成抗體治療腫瘤的研究最近也取得了很大的進展。n 在動物模型中用抗血管生成因子、抗體封閉血管內(nèi)皮生長因子取得了抑制腫瘤生長作用；n 抗癌基因產(chǎn)物抗體 Herceptin〔 r〕作為生物技術(shù)藥品已經(jīng)廣泛用于臨床，配合化療用于乳腺癌和卵巢癌的治療，并獲得較好療效。第一百二十一 頁 ，共一百二十三 頁 。第一百二十二 頁 ，共一百二十三 頁 。內(nèi)容 總結(jié)分子生物學(xué) 實 用技 術(shù) ?！?4〕 H鏈 和 L鏈 相互隨機配 對 。 “快融〞：取出立即浸入37℃ ～ 40℃ 水浴中，使其迅速融化、。利用 這 些序列不 僅 可能使抗原性降到最低限度，而且可能保持原抗體的 親 和性。 連 接 肽 〔 約 1525個氨基酸〕 連 接而成的重。選擇 能力和再 擴 增能力相 結(jié) 合。在 動 物模型中用抗血管生成因子、抗體封 閉 血管內(nèi)皮生 長 因子取得了抑制 腫 瘤生 長 作用。 Thank you第一百二十三 頁 ，共一百二十三 頁 。