【正文】 導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使其在細(xì)胞內(nèi)特定部位表達(dá)，通過與靶抗原的結(jié)合影響其生物學(xué)活性。第九十四 頁 ，共一百二十三 頁 。輕鏈 FR1中有一種序列只有一個(gè)殘基不同，重鏈 FR3中有一種序列只有兩個(gè)殘基不一致。構(gòu)建改形抗體的一般性原那么1. VH和 VL的序列均應(yīng)盡可能選自人的同一種 Ig，以減少兩條鏈裝配的不親和性。第八十六 頁 ，共一百二十三 頁 ?？贵w基因的修飾及表達(dá)載體的構(gòu)建 這一技術(shù)是將對(duì) Ig基因結(jié)構(gòu)與功能的了解與 DNA重組技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)研究者的意圖采用基因工程方法，在基因水平對(duì) Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，甚至是人工全合成后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體，也稱為第三代抗體。〔 3〕可能含有病毒第七十四 頁 ，共一百二十三 頁 。〔 3〕可重復(fù)性第六十九 頁 ，共一百二十三 頁 。710天，小鼠腹部脹大，用注射器抽取腹水， 5B.牛血清， 50%～ 60%細(xì)胞凍存 防止細(xì)胞密度過高而死亡第六十五 頁 ，共一百二十三 頁 。(5)陽性孔轉(zhuǎn)種 24孔細(xì)胞板擴(kuò)增，及時(shí)檢測、做第二次有限稀釋、凍存。+培基 +培基 有限稀釋法(1)含飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔細(xì)胞板。微量細(xì)胞毒試驗(yàn)常用的方法：固相放射免疫測定——100177?？梢娙诤霞?xì)胞12天 雜交瘤細(xì)胞0天 714天： HT(3)方法HGPRTH脾細(xì)胞 HAT培基，調(diào)整細(xì)胞濃度 5╳， 10分鐘。30%其純度與毒性有所不同MW： 600， 1000， 1500， 4000， 6000細(xì)胞膜容易被翻開，最終引起細(xì)胞融合。制備單細(xì)胞懸液 → ↘ 收集細(xì)胞 (對(duì)數(shù)生長期 )小鼠 → G.激光法A.定義大鼠脾臟：小鼠脾臟： Balb/c〔 2〕免疫脾細(xì)胞目的104生長慢培養(yǎng)技術(shù)較困難第四十一 頁 ，共一百二十三 頁 。SK007人骨髓瘤細(xì)胞SP2/03.McAb與 PcAb的比較McAb PcAb抗原要求 可以不純 純度高得量 高 低特異性 高 低穩(wěn)定性 低 高沉淀反應(yīng) 無 有成本 高 低第三十九 頁 ，共一百二十三 頁 。107antibody第三十二 頁 ，共一百二十三 頁 ?？贵w種類：第一代抗體：多克隆抗體抗體對(duì)抗原的結(jié)合是一種典型的特異性免疫結(jié)合，抗體結(jié)合抗原的部位位于 Fab片段可變區(qū)結(jié)構(gòu)域中的 CDR區(qū)。–determining(1,第十七 頁 ，共一百二十三 頁 。后引入 “ 抗體〞一詞泛指抗毒素類物質(zhì)。.1984年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第九 頁 ，共一百二十三 頁 。 1975在英國劍橋醫(yī)學(xué)研究會(huì)研究出一種新技術(shù)，可使鼠細(xì)胞與人類細(xì)胞融合，產(chǎn)生一種被稱為“雜交瘤〞的細(xì)胞。.提出了間接模板學(xué)說和獲得性免疫的無性繁殖系選擇學(xué)說，對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)及分子遺傳學(xué)具有極其重要的意義。1977年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第七 頁 ，共一百二十三 頁 。但是這一重要研究成果開始并未得到大家的成認(rèn)，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為象胰島素這樣的小分子并不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體?？贵w的結(jié)構(gòu)和它的特異性之間的貢(Rodney1929)美國生物化學(xué)家 最早用化學(xué)反響解釋免疫過程。Ehrlich,1890年德國的 貝 林 (Emil血清 療 法：技 免疫學(xué)的科學(xué)早期 隨后，被稱之 為 “抗血清〞。第四 頁 ，共一百二十三 頁 。1969年 4月，在美國實(shí)驗(yàn)生理學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)第 53次年會(huì)上， Edelman正式宣布：自己已解決抗體分子最詳盡的化學(xué)結(jié)構(gòu)即其氨基酸序列問題。19171986)英國生物化學(xué)家 因開發(fā)了放射免疫分析法， 1977年獲得諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。R.Bur,他與與著名生物化學(xué)家米爾斯坦共同研究開發(fā)出一套制備單克隆抗體的新技術(shù)，被譽(yù)為上世紀(jì) 70年代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)革命。G.1927)生物化學(xué)家〔英國和阿根廷雙重國籍〕 1984年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第十 頁 ，共一百二十三 頁 。Jerne,n 免疫球蛋白可分為分泌型〔 secreted Ig, SIg〕膜型〔membrane Ig, mIg〕兩種。constant(高可變區(qū) )Framement(1,2,3)第二十 頁 ，共一百二十三 頁 。〔五〕抗體基因的遺傳控制完整的抗體分子由輕鏈〔包括 κ和 λ〕基因和重鏈基因編碼。κ 鏈基因的重排第二十七 頁 ，共一百二十三 頁 ?？贵w的產(chǎn)生有三種條途徑：經(jīng)典途徑：即免疫動(dòng)物產(chǎn)生多克隆抗體〔抗 特點(diǎn)：繼承淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體第三十四 頁 ，共一百二十三 頁 。(3)與蛋白交聯(lián)，如白蛋白、 KLH等(4)╳ 105 (細(xì)胞 )程序： 常規(guī) 0、 2 42天免疫， 52天試血， 融合前 3天加強(qiáng)免疫 快速 0、 1 28天免疫， 38天試血， 融合前 3天加強(qiáng)免疫第三十六 頁 ，共一百二十三 頁 。種類：小鼠骨髓瘤細(xì)胞A.吞噬壞死細(xì)胞第四十四 頁 ，共一百二十三 頁 。自發(fā)觸發(fā)C.(2)整個(gè)過程 (融合前一天 )注入 Hank’s→ 復(fù)蘇 (前 7天 177。95%，總數(shù) 計(jì)數(shù)，活力測定。細(xì)胞毒性 ↑融合率低 50%，每孔 。雜交瘤細(xì)胞 胸腺嘧啶核苷激酶第五十 頁 ，共一百二十三 頁 。主要合成途徑糖、氨基酸　　 A阻斷TA.良好 大部死亡 10個(gè)細(xì)胞57天 死亡 ——選育出穩(wěn)定而同源的細(xì)胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞。軟瓊脂平板法10+培基 → …B → 5細(xì)胞 /ml復(fù)蘇第六十六 頁 ，共一百二十三 頁 。預(yù)防： (1)培基中加適當(dāng)濃度的抗生素。第六十七 頁 ，共一百二十三 頁 。人 人： 產(chǎn)生抗體的細(xì)胞濃度 C取決于總的細(xì)胞濃度及分泌抗體細(xì)胞的 %。預(yù)處理 1周 2月內(nèi)，用雜交瘤細(xì)胞攻擊。只。牛淋巴液體外循環(huán)培養(yǎng)法DNA重組的細(xì)菌發(fā)酵法第七十二 頁 ，共一百二十三 頁 。多抗 IgG56℃ pH68穩(wěn)定 (2)：羥基磷灰石柱層析、 SephadexG200基因工程抗體的分子量較小，可以局部降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位。1.3.根本原理 從雜交瘤細(xì)胞 /淋巴細(xì)胞基因組中別離和鑒別出功能性的 VL和 VH基因，分別與人的輕、重鏈恒定區(qū)基因相連接，插入適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成人－鼠嵌合的重鏈和輕鏈基因，然后共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合抗體。antibody〕，也稱為改形抗體或重構(gòu)型抗體〔reshaping還有一些 FR的氨基酸殘基直接與抗原接觸。 第九十 頁 ，共一百二十三 頁 。 第九十五 頁 ，共一百二十三 頁 。 第一百 頁 ，共一百二十三 頁 。此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。第一百零三 頁 ，共一百二十三 頁 。一類是將 Fv段與其他生物活性蛋白如毒素、酶等結(jié)合，利用抗體的特異性識(shí)別功能將某些生物活性物質(zhì)引導(dǎo)到特定部位。這種噬菌體抗體可以特異識(shí)別抗原，又能感染宿主進(jìn)行再擴(kuò)增。:第一百零九 頁 ，共一百二十三 頁 。 第一百一十四 頁 ，共一百二十三 頁 。第一百一十八 頁 ，共一百二十三 頁 。n 用以制備這類導(dǎo)向藥物的抗癌藥物主要有阿霉素〔adriamycin〕、氨甲蝶呤〔 MTX〕等?！?4〕 H鏈 和 L鏈 相互隨機(jī)配 對(duì)