【正文】 0p 在商業(yè)允許的劑量下處理的輻照食品對食品安全性的影響甚微， 對人類健康無任何實際危害p 不能因為對輻照技術(shù)的恐懼和不了解而阻止輻照技術(shù)在食品工業(yè)的應(yīng)用p 加強食品輻照技術(shù)的宣傳，讓更多的企業(yè)和公眾了解輻照技術(shù)對食品安全性的影響，消除人們心理障礙，推進輻照技術(shù)在食品工業(yè)的應(yīng)用， 讓輻照技術(shù)更好的保障我國的食品安全 小結(jié)161補充： ELISA一、免疫學(xué)基本概念l 抗原： 能刺激機體免疫系統(tǒng)啟動免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)特性 l 免疫原性 l 免疫反應(yīng)性162p半抗原： 只有免疫反應(yīng)性，而無免疫原性的小分子物質(zhì)。如藥物、多糖、類脂等。p載體：賦予半抗原具有免疫原性的蛋白質(zhì)分子，即為載體，通常用的 BSA、 OVA 注意：制備半抗原抗體，必須首先將半抗原耦聯(lián)到蛋白質(zhì)163p抗原表位或抗原決定簇： 指存在于抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團。其性質(zhì)、數(shù)量和空間構(gòu)象決定了抗原的特異性。164p抗體： B細胞在抗原的刺激下分化為漿細胞，產(chǎn)生具有與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白，主要存在血清或其他體液中165抗體應(yīng)用形式p多克隆抗體 (polyclonal antibody)： 由多個抗原決定簇刺激不同的 B細胞產(chǎn)生的p單克隆抗體 (monoclonal antibody)： 由一個 B細胞分泌的抗體p基因工程抗體： 應(yīng)用基因工程技術(shù)對需要的抗體進行改造所獲得的抗體166二、抗體制備（一）多克隆抗體 直接免疫動物，如兔、羊、鼠等，獲取血清即可。 產(chǎn)生多種針對不同表位的相應(yīng)抗體167（二）單克隆抗體p1975年德國學(xué)者 Kohler和英國學(xué)者 Milstein創(chuàng)造了雜交瘤技術(shù)， 獲得諾貝爾獎p雜交瘤細胞既具有骨髓瘤細胞大量無限生長繁殖的特性，又具有抗體形成細胞合成和分泌抗體的能力p特異性強168169170（三）基因工程抗體p 原理： 細胞獲得編碼抗體的基因，或以多聚酶鏈反應(yīng)擴增技術(shù)基因片段，經(jīng)體外 DNA重組后，轉(zhuǎn)化受體細胞，使其表達特定抗體p 如：人 鼠嵌合抗體、雙特異性抗體、改型抗體等 嵌合抗體：鼠源抗體的 V區(qū)和人源的 C區(qū)重組后可得，保留了抗體對抗原的高親和力，同時減弱了鼠源抗體的免疫原性。171172三、抗體在食安檢測中的應(yīng)用p 酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzymelinked immunosorbent assay ， ELISA)p 試紙條測定 —— 膠體金技術(shù)p 免疫親和柱p 免疫微球p 免疫傳感器p 聯(lián)用技術(shù)，如 PCRELISA、 ABSELISA等p 免疫印跡、生物芯片等173（一）、 ELISA基本原理pELISA的基礎(chǔ)： 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記p結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性p酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的性17496孔板175p基本原理： 在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析176（二）、酶及其底物酶 底 物 顯色反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2‘ 連胺基 2(3乙基 并噻唑啉磺酸 6)銨鹽 橘紅色黃色棕色蘭色藍綠色492460449425642堿性磷酸酯酶 4硝基酚磷酸鹽 (PNP)萘酚 ASMx磷酸鹽 +重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖 +甲硫酚嗪 +噻唑蘭 黃色深藍色 405420 β Ｄ－半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷 (4MuG)硝基酚半乳糖苷 (ONPG) 熒光黃色 360,450420 177（三）常用類型p間接法： 測抗體水平，反推抗原p雙抗體夾心法： 直接測抗原p捕獲抗體法： 直接測小分子抗原p間接競爭法 ：直接測小分子抗原p應(yīng)用親和素和生物素的 ELISA等等178間接法是檢測 抗體 最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體食品安全中常用于檢測活體中的病原體 ，如禽流感病毒間接法、間接法179間接法測抗體（反推抗原的存在）間接法測抗體（反推抗原的存在）180一般步驟p包備： 將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原p測樣： 加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)，洗滌p添加二抗： 加酶標二抗，保溫反應(yīng)， 洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關(guān) p顯色： 加底物顯色p終止181酶標儀182雙抗體夾心法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、細菌、病毒等183一般步驟p 包被： 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。p 測樣： 加受檢標本（抗原），保溫反應(yīng)，洗滌p 加酶標抗體： 加酶標抗體，保溫反應(yīng)，洗滌，此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。 p 顯色： 加底物顯色　p 終止 　184競爭法p原理： 標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法185186間接競爭法187以瘦肉精為例 —— 抗體制備及檢測合成完全抗原： 將瘦肉精與蛋白質(zhì)（ BSA）偶聯(lián)，并測定偶聯(lián)是否成功 ???一定要有與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的基團（ COOH、 NH OH、 SH、 NO2）188抗體制備：免疫動物：多抗（兔）、單抗（小白鼠）抗體監(jiān)測：效價、特異性、靈敏度抗體純化：189建立 ELISA方法國內(nèi)常用：間接競爭 ELISA國外常用：捕獲抗體 ELISA摸索指標：靈敏度、特異性、準確性、假陽性率、假陰性率等190間接競爭 ELISA－測瘦肉精191捕獲抗體 ELISA －測瘦肉精192193ELISA小結(jié)p基本原理： 抗原抗體反應(yīng)、酶促反應(yīng)pELISA應(yīng)用形式比較靈活，可測定抗原、抗體pELISA在食安領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛：細菌、病毒、真菌毒素、寄生蟲、農(nóng)藥、獸藥、有機污染物等如何建立重金屬 ELISA方法？194PCR檢測微生物 聚合酶鏈式反應(yīng) ( PCR) ：可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增 。在擴增反應(yīng)結(jié)束之后，可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性的分析和定量的分析 。195PCR原理圖 3’3’3’變性、退火延伸變性、退火、延伸3’196197常規(guī) PCR方法的局限性p 無法對起始模板準確定量 ,只能對終產(chǎn)物進行分析p 必須在擴增后用電泳方法分析 ,費時費力而且 EB有毒p 無法對擴增反應(yīng)實時檢測198p 實時定量 PCR技術(shù)，是指在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程p 實時熒光定量 PCR是目前確定樣品中 DNA (或 cDNA) 拷貝數(shù)最敏感、最準確的方法。199原理p 反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標記物 (熒光探針 )與擴增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比 ,因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。200p 每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值。p 模板起始濃度越高， Ct值越小201? 如果模板濃度增加 1倍， Ct值就提前 1個循環(huán)到達? 如果模板濃度減少 1倍， Ct值就滯后 1個循環(huán)到達 202利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表 Ct值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 203謝謝觀看 /歡迎下載BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH