western-blot原理及操作流程1116-資料下載頁(yè)
2025-02-24 14:00本頁(yè)面
【正文】 ogen, Sigma, Abcam, RD, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.雜交需要試劑－底物顯色底物 ： 操作簡(jiǎn)單，靈敏度低，如 TMB、DAB、 BCIP/NBT化學(xué)發(fā)光底物 ： 靈敏度高，需要曝光檢測(cè)設(shè)備（暗室、曝光設(shè)備和膠片）或者凝膠成像設(shè)備。結(jié)果分析使用 Photoshop 檢測(cè)灰度值使用 graphpad做柱狀圖WB常見問(wèn)題沒有信號(hào)高背景非特異性條帶條帶大小不對(duì)標(biāo)本問(wèn)題 l 標(biāo)本中不含檢測(cè)蛋白：設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照l(shuí) 上樣量不夠，或者蛋白表達(dá)豐度比較低：增加上樣量轉(zhuǎn)膜問(wèn)題l 轉(zhuǎn)膜不完全：轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色，確定目的大小蛋白條帶是否存在于膜上，使用蛋白質(zhì) Marker.l 洗滌過(guò)度：減少洗滌時(shí)間和次數(shù) .封閉l 封閉過(guò)度：減少封閉試劑濃度，封閉時(shí)間，更換封閉試劑抗體孵育和檢測(cè)l 抗體濃度和時(shí)間孵育不夠：增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間l 一抗不工作：設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照l(shuí) 二抗不工作：和其他一抗配合檢測(cè)二抗是否工作l 一抗 /二抗不匹配：檢查抗體的來(lái)源和亞型。正確選擇二抗l 底物失活：重新配制有效的底物沒有信號(hào) /弱信號(hào)背景高封閉l 封閉時(shí)間不夠：延長(zhǎng)封閉時(shí)間l 優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度l 封閉試劑和抗體有交叉反應(yīng)：更換封閉試劑 .l 磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑：推薦 BSA封閉抗體孵育和檢測(cè)l 一抗 /二抗?jié)舛忍撸航档涂贵w濃度l 孵育溫度太高：建議 4度孵育過(guò)夜其他l 洗膜不充分： 5*3mins，多次短時(shí)間的洗膜l 曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：縮短曝光時(shí)間l 出現(xiàn)干膜現(xiàn)象：保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜l 二抗非特異性：設(shè)置只加二抗對(duì)照非特異性條帶標(biāo)本制備l 二聚體或者多聚體：增加上樣前煮沸變性時(shí)間l 蛋白不同剪切體或者 isoforms 存在 .l 蛋白降解：使用新鮮制備的標(biāo)本，標(biāo)本中加入新鮮配制的蛋白酶抑制劑l 上樣量過(guò)大：減少上樣量封閉 Blockingl 封閉不充分：優(yōu)化封閉時(shí)間和封閉試劑濃度抗體孵育和檢測(cè)l 一抗 /二抗?jié)舛冗^(guò)高：降低抗體濃度l 抗體沒有經(jīng)過(guò)純化l 二抗非特異性結(jié)合：使用二抗對(duì)照其他l 洗膜保證充分Thank you！演講完畢，謝謝觀看
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