western-blot原理及操作流程1116-在線瀏覽
2025-03-28 14:00本頁面
【正文】 ， % PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, ， 216。一 、蛋白樣品的制備蛋白樣品的定量 (Bradford法 )原理 — 考馬斯亮藍(lán) G250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。目前世界上最常用的蛋白濃度檢測(cè)方法是：BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (BCAAssayProteinKit)法與傳統(tǒng)方法相比，更簡(jiǎn)單、更穩(wěn)定、更靈敏度。BCA法測(cè)定蛋白濃度兼容性亦很好，其不受大部分樣本中其他成分的影響，對(duì)于 5%以內(nèi)的 SDS、 Triton 80具有很好的兼容性。在 BCA法測(cè)定蛋白濃度前，應(yīng)盡量使 EDTA濃度 ≤m10M。DTT濃度 ≤1mM， 2ME≤%。BCA法在 50～1000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系， 2030 ug 細(xì)胞 /組織裂解物 100 ng 純化蛋白根據(jù)蛋白表達(dá)豐度調(diào)整適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘恿可蠘恿恳恢拢好靠咨蠘恿勘３忠恢律蠘忧坝?loading buffer加熱變性樣本三、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，因此電泳時(shí)可以從負(fù)極向正極移動(dòng)Anode 內(nèi)槽緩沖液帶有負(fù)電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode +帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從上到下運(yùn)動(dòng)（負(fù)極到正極），分開電泳進(jìn)程可以根據(jù)前沿指示劑來確定，等其跑到底部上面 1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比較快 . 蛋白根據(jù)分子量大小分開標(biāo)本加入到上樣孔中濾紙凝膠膜濾紙 +四、 Western Blot 轉(zhuǎn)膜 分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜方式從凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交膜上（ PVDF或 NC膜）PVDF膜： 價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。Western的具體步驟轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備制作 “三明治 ”“黑膠白膜 ”Western的具體步驟轉(zhuǎn)膜 Western的具體步驟轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜條件：推薦： 100V ， 1——2 小時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。Blot為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜是否成功，可用相關(guān)染料對(duì)膜進(jìn)行染色。倒掉一抗溶液，用 PB
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