【正文】 胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平168。EGF能提高 EF1αmRNA的轉(zhuǎn)錄量和蛋白質(zhì)的表達(dá)。168。Reza等將用作結(jié)合 DNA的結(jié)構(gòu)域 鋅指結(jié)構(gòu)和 VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建了人工轉(zhuǎn)錄激活因子，將 CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率提高了 2倍多。（ 2）翻譯水平的調(diào)控mRNA壽命、 mRNA的翻譯起始效率和翻譯產(chǎn)物的加工修飾的效率等也對(duì)目的基因的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響。（ A）內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) (IRES)能使同一 mRNA中除第 1個(gè)基因之外的其他基因也得到有效表達(dá)。（ B）翻譯增強(qiáng)子可提高翻譯效率。（ C）使用宿主細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子來(lái)對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。（ 3）整合位點(diǎn)的優(yōu)化168。目的基因在 CHO細(xì)胞染色體上整合位點(diǎn)區(qū)域的狀態(tài)對(duì)于目的基因的表達(dá)與否、表達(dá)高低以及目的基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性起著決定性的作用。168。只有那些整合位點(diǎn)處于染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的細(xì)胞形成的克隆才可高水平表達(dá)目的基因。（ A）選擇基因 (如 neo)的弱化表達(dá)，使大量整合在低表達(dá)整合位點(diǎn)的細(xì)胞由于選擇標(biāo)記基因表達(dá)量不夠而在選擇培基條件下死亡。（ B）在載體上添加染色體上的某些特定序列 (如骨架 /基質(zhì)附著區(qū) )，使表達(dá)載體整合到宿主細(xì)胞的染色體后能模擬染色體的高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)。3）宿主細(xì)胞168。常用的幾種用于表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株BHK21細(xì)胞 CHOK1細(xì)胞168。C127細(xì)胞 MDCK細(xì)胞168。Namalwa細(xì)胞 Vero細(xì)胞168。鼠骨髓瘤細(xì)胞 COS細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞株 (如 Sp2/0和 J558L) 不同的細(xì)胞對(duì)重組蛋白的修飾可能會(huì)稍有差別。168。發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞株：來(lái)源于 MadinDarby犬腎的高分化內(nèi)皮細(xì)胞株 (MDCK)，表達(dá)分泌型的基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP13。高表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆可占轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 5％～ l0％，而同樣的載體在 CHO細(xì)胞中僅得到低水平的表達(dá)。168。對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞株進(jìn)行遺傳改造：基于腺病毒 E1A蛋白可反式激活 CMV啟動(dòng)子， Cockett等建立了 穩(wěn)定表達(dá)E1A的 CHO細(xì)胞株， 在該細(xì)胞中重組前膠原酶的產(chǎn)量與 CHO細(xì)胞相比增加了 12倍。4)常用的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(1)CHO/DHFR和 CHO/NEOSPLA 表達(dá)系統(tǒng)（ 2） C127/BPV1系統(tǒng)（ 3）骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)5）表達(dá)系統(tǒng)方式（ 1）瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)：168。宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體 DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)限短暫。168。簡(jiǎn)捷，實(shí)驗(yàn)周期短，規(guī)模大。168。技術(shù)條件要求高，如質(zhì)粒的純度、轉(zhuǎn)染的效率等。（ 2）穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)：168。載體進(jìn)入宿主細(xì)胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體 DNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)持久、穩(wěn)定。168。由于需抗性選擇甚至加壓擴(kuò)增等步驟，穩(wěn)定表達(dá)相對(duì)耗時(shí)耗力。（ 3）誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：168。目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導(dǎo)后才得以開(kāi)放。168。早期 — 糖皮質(zhì)激素、重金屬離子 — 特異性低、毒性高。168。近年 — 非哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的調(diào)控蛋白 — 外源基因表達(dá)低、誘導(dǎo)效應(yīng)高。6）基因的導(dǎo)入方法光穿孔法 沖擊波法基因槍法 穿孔法磷酸鈣共沉淀法 脂質(zhì)體法抗體轉(zhuǎn)染法 其他7）展望（一）改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量 （二）利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本 “代謝工程 ”改造工程細(xì)胞 ，降低生產(chǎn)成本（三）抑制細(xì)胞調(diào)亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（四）采用 “糖基化 ”工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量植物生物反應(yīng)器（ Plant Bioreactor）168。植物生物反應(yīng)器 是指通過(guò)基因工程途徑，以常見(jiàn)的農(nóng)作物作為 “化學(xué)工廠 ”，通過(guò)大規(guī)模種植生產(chǎn)具有高經(jīng)濟(jì)附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類及其它一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法。1）植物生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)168。植物生物反應(yīng)器的廉價(jià)性168。植物生物反應(yīng)器的安全性168。植物具有真核生物的加工修飾能力168。植物生產(chǎn)系統(tǒng)的實(shí)用性2）植物生物反應(yīng)器的生產(chǎn)流程168。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的領(lǐng)域方向主要有三個(gè)：一是 藥用蛋白 ，二是 醫(yī)用抗體 ，三是 疫苗。 168。原理是將目的基因?qū)胫参?，使其在植物中表達(dá)，人或動(dòng)物攝取該植物或其中的蛋白后達(dá)到預(yù)期目的。3）植物反應(yīng)器的載體系統(tǒng)病毒載體系統(tǒng) 農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)感染率高，短時(shí)間內(nèi)較大表達(dá)量 轉(zhuǎn)化率較低瞬時(shí)表達(dá)，外源基因不能整合 整合到植物基因組，穩(wěn)定遺傳最好是雙鏈 DNA植物病毒 TDNA和 Vir基因同時(shí)參與轉(zhuǎn)化CaMV、 TMV、 CPMV、 PVX 根瘤農(nóng)桿菌（ Ti質(zhì)粒）、發(fā)根農(nóng)桿菌（ Ri質(zhì)粒）4）植物遺傳轉(zhuǎn)化方法載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 基因直接轉(zhuǎn)化病毒載體 農(nóng)桿菌質(zhì)粒 鳥槍法 PEG介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)植物組織 細(xì)胞原生質(zhì)體 生殖細(xì)胞形成愈傷組織進(jìn)而完整的轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)化率高， 但 外源基因穩(wěn)定性差“裸露細(xì)胞 ”，全能性易操作，效率高， 但 遺傳穩(wěn)定性更差，周期長(zhǎng)花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞 單倍體培養(yǎng)或利用受精過(guò)程導(dǎo)入較強(qiáng)的接受外源 DNA能力， 但 受季節(jié)限制5）植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)幾點(diǎn)關(guān)鍵問(wèn)題1. 基因表達(dá)的有效性2. 啟動(dòng)子 的選擇 — 組成型啟動(dòng)子花椰菜花葉病毒（CaMV）的 35啟動(dòng)子，活性高且能穩(wěn)定表達(dá)。3. 信號(hào)肽 — 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽（ SP）、 C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列等4. 標(biāo)記序列 —Cmyc 、組蛋白等5. 2. 基因表達(dá)的穩(wěn)定性6. 不斷選擇高水平表達(dá)外源蛋白量的株系；7. 選擇具有良好貯藏功能的器官作為植物反應(yīng)器的表達(dá)部位重組蛋白的純化口服疫苗 — 不需要精確的提純基因融合 — 定向引導(dǎo)重組蛋白于特定細(xì)胞器或組織，簡(jiǎn)化提純步驟重組產(chǎn)物的特性糖基化模式的差別 — 去除 N糖基大田生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估抗性基因，轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散，轉(zhuǎn)基因作物安全6）植物生物反應(yīng)器的特點(diǎn)原核微生物反 應(yīng) 器 植物反 應(yīng) 器 動(dòng) 物反 應(yīng) 器真核蛋白翻 譯 后加工的能力有限 上游生 產(chǎn) 成本 較 低細(xì) 胞培養(yǎng)需要用胎牛血清作 為生 長(zhǎng) 培養(yǎng)基，以及從培養(yǎng)上清中提取，成本昂 貴細(xì) 菌 發(fā) 酵常形成不溶聚合物（包涵體）或回收率低基因 轉(zhuǎn) 化容易、成功率高、周期短、 轉(zhuǎn) 化率高、提 純 容易、收效快（少上兩年）轉(zhuǎn) 基因 動(dòng) 物生 長(zhǎng) 繁殖、 飼 養(yǎng)條件及 營(yíng) 養(yǎng)要求高宿主菌的表達(dá) 藥 物種 類 及表達(dá)量有限轉(zhuǎn) 基因植物自交后得到的同 質(zhì)后代的 遺傳 性狀 穩(wěn) 定， 進(jìn)而在植物體內(nèi) 積 累多基因基因 轉(zhuǎn) 化 難 度大、 轉(zhuǎn) 化成功率低、生 產(chǎn)藥 物等待周期 長(zhǎng)（牛 7年，羊 3年）噬菌體等 污 染造成倒灌的威 脅 不存在噬菌體 污 染造成倒灌的威 脅 動(dòng) 物反 應(yīng) 器的 污 染 問(wèn)題下游加工復(fù) 雜 、成本高； 發(fā) 酵常常需 龐 大的 設(shè)備 投 資 可食 藥 物 節(jié) 省下游加工開(kāi)支轉(zhuǎn) 基因 動(dòng) 物易 產(chǎn) 生社會(huì)和 倫 理問(wèn)題7）前景展望168。 隨著新功能基因的分離、克隆以及各種農(nóng)作物高效表達(dá)技術(shù)平臺(tái)的逐步建立，在今后 15至 20年內(nèi)，將會(huì)有相當(dāng)數(shù)量的高新生物技術(shù)產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)并與消費(fèi)者見(jiàn)面。這種 “分子農(nóng)業(yè) ”的出現(xiàn)及普及將會(huì)對(duì)我國(guó)現(xiàn)有的 農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu) 產(chǎn)生顯著影響，對(duì)增強(qiáng)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)能力、極大的提高農(nóng)民的收入以及維護(hù)農(nóng)業(yè)的 可持續(xù)發(fā)展 具有重要意義。同時(shí)，也有利于形成 新的產(chǎn)業(yè)鏈 ，培育出較大的產(chǎn)業(yè)集團(tuán)。 謝謝謝謝觀看 /歡迎下載BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. 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