【正文】 的蛋白質(zhì)分開(kāi)。 中性鹽在低濃度時(shí)，可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象叫鹽溶。當(dāng)溶液離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度下降開(kāi)始沉淀，這種現(xiàn)象叫鹽析。 （三）根據(jù)電荷不同的分離方法 在外界電場(chǎng)的影響下，如果蛋白質(zhì)不處于等電點(diǎn)狀態(tài)，它將向電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。純化中應(yīng)用最多的是聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳，它們既可以作為蛋白質(zhì)純度檢驗(yàn)方法，也可以純度、制備蛋白質(zhì)。 常見(jiàn)垂直平板電泳示意圖 層析法是利用被分離樣品混合物中各組分的化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)“相”中，這兩個(gè)相中的一個(gè)被固定在一定的支持介質(zhì)上，成為固定相，另一個(gè)是移動(dòng)的，成為移動(dòng)相。 根據(jù)層析法的原理與方式的不同，層析法有分配層析、吸附層析、離子交換層析、親和層析等不同類別。 凝膠過(guò)濾層析 ? 凝膠過(guò)濾又稱分子篩層析 （ molecularsieve chromatography)。這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。凝膠過(guò)濾是一種柱層析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常用的有葡聚糖凝膠（商品名為 Sephadex)和瓊脂糖凝膠（商品名為 .Sepharose）等。葡聚糖凝膠是具有不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，它的“網(wǎng)孔”大小可以通過(guò)控制交聯(lián)劑與葡聚糖的比例來(lái)達(dá)到。不同型號(hào)的葡聚糖凝膠裝在層析柱中，不同分子的蛋白質(zhì)混合物借助重力通過(guò)層析柱時(shí)，比“網(wǎng)孔”大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)格內(nèi)，而被排阻在凝膠粒之外，隨著洗脫劑通過(guò)凝膠粒外圍而流出；比“網(wǎng)孔”小的分子則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠粒內(nèi)部，然后再可逆地?cái)U(kuò)散出來(lái)通過(guò)下層凝膠。這樣，由于不同大小的分子所經(jīng)路程不同而得以分離， 大分子先洗下來(lái) ， 小分子后洗下來(lái)。 凝膠層析原理及流程 離子交換層析 離子交換層析分離蛋白質(zhì)也是根據(jù)其 帶電荷 的情況。常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑有弱酸性的羧甲基纖維素（ carboxymethylcellulose, 簡(jiǎn)稱 CM一纖維素）和弱堿性的二已基氨基已基纖維素（ diethylaminoethylcellulose，簡(jiǎn)稱 DEAE一纖維素），前者為陽(yáng)離子交換劑，后者為陰離子交換劑。離子交換層析原理及簡(jiǎn)單流程： 離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷的靜電吸引，這與溶液的 pH值有關(guān)，因?yàn)槿芤旱?PH值決定離子交換劑與蛋白質(zhì)的電離程度。鹽類的存在可以降低離子交換劑的離子和蛋白質(zhì)的相反電荷基團(tuán)之間的靜電吸引。因此，蛋白質(zhì)混合物的分離可用改變?nèi)芤褐宣}類離子強(qiáng)度和 PH值來(lái)完成。對(duì) 離子交換劑結(jié)合力最小 的蛋白質(zhì) 首先 由層析柱中洗脫出來(lái)。 離子交換原理及流程 示意圖 親合層析 親和層析 ( affinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法。它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步的處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法根據(jù)的是某些蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)性質(zhì)，即它們與另一種稱為配體的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合。 親合層析原理及流程示意圖 五 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 （一）蛋白質(zhì) 含量的測(cè)定 ： ： 此法是用紫外吸收分光光度計(jì)在紫外光區(qū)測(cè)定蛋白質(zhì)的光吸收，從而測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。 ? 在強(qiáng)堿性溶液中，蛋白質(zhì)與 CuSO4反應(yīng)，生成紫紅色化合物，這個(gè)反應(yīng)稱為 雙縮脲反應(yīng) （ biuret reaction)。 ? 在堿性條件下，蛋白質(zhì)與 CuSO4所生成的顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃渡成 正比 ，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸組成無(wú)關(guān)。將樣品同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)同時(shí)試驗(yàn)，并于 540560nm波長(zhǎng)下側(cè)其 光吸收值 ，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線即可求得蛋白質(zhì)的含量。 ? 此方法簡(jiǎn)便、迅速，不受蛋白質(zhì)特異性的影響，但方法的靈敏度較差，所需樣品量大（ ）。 3．福林一酚試劑法 ? 福林一酚試劑（ Folinphenol reagent )包括兩組試劑：堿性銅試劑和磷鉬酸及磷鎢酸的混合試劑 。堿性銅試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，這是蛋白質(zhì)中肽鍵的反應(yīng)，這種被作用的蛋白質(zhì)中的酚基（酪氨酸），在堿性條件下很容易將磷鉬酸和磷鎢酸還原為藍(lán)色的 鉬藍(lán)和鎢藍(lán) ，所生成藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此，在650nm或 660nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，即可測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 ? 這個(gè)方法實(shí)際上是勞里（ Lowry, O, H., 1951）在原方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)了的，常稱 Lowry法，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高（比雙縮脲法靈敏 100倍）等優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)測(cè)定范圍為 25250181。g/ml。但不同蛋白質(zhì)顯色強(qiáng)度稍有不同，而且酚類物質(zhì)和檸檬酸有干擾。 4. 紫外吸收法 ? 蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、色氨酸在 280nm左右具有最大吸收，由于在各種蛋白質(zhì)中這幾卜種組基酸含量差別不大，所以280nm的吸收值與濃度具正相關(guān)，可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。此種方法稱為 280nm吸收法。其方法簡(jiǎn)便，測(cè)定迅速，樣品可回收，低濃度鹽無(wú)干擾。但若樣品蛋白質(zhì)中酪氨酸含量與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)比較差別較大，則測(cè)定有一定誤差，其它具有紫外吸收的物質(zhì)（如 核酸類）有干擾 。 ? 另外， 280nm和 260nm吸收差法也常用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。在被測(cè)樣品中常含有核酸類物質(zhì)。利用核酸類物質(zhì)的吸收值在 260nm大于 280nm，而蛋白質(zhì)的吸收值在 280nm大于 260nm的特性，可分別于 280nm和 260nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值（分別以 A280和 A260表示）。然后按下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算蛋白質(zhì)的含量： ? 蛋白質(zhì)濃度（ mg/ml ) = 蛋白質(zhì)作為機(jī)體的結(jié)構(gòu)成分而存在，常見(jiàn)的蛋白質(zhì)的生物機(jī)能： 肌肉的構(gòu)成 ? 骨骼肌以及很多非肌肉細(xì)胞含有兩種形成特有的纖維狀或絲狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)：肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白。按生物功能來(lái)說(shuō)它們不是基本的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，它們參與需能的收縮活動(dòng)。 ? 肌球蛋白是一種很長(zhǎng)的捧狀分子，有兩條彼此纏繞的“ — 螺旋肽鏈的尾巴和一個(gè)復(fù)雜的“頭”。它的總分子量為 450000，約 160nm長(zhǎng)，實(shí)際上含有六條肽鏈。 ? 長(zhǎng)尾巴是由二條分子量各為 202200的肽鏈組成，這兩條肽鏈稱為重鏈 (heavy chain H鏈 )。重鏈具有柔軟的可轉(zhuǎn)動(dòng)鉸鏈。 ? 頭是球形的，含有重鏈的末端和四條輕鏈 (light chain， L鏈 )，其中兩條稱作 L2，分子量為 18000，另外兩條稱為 Ll和 L3,分子量分別為 16000和 25000。肌球蛋白分子的頭部具有酶活性，催化 ATP水解成ADP和磷酸，并釋放能量。許多肌球蛋白分子裝配在一起形成骨骼肌的粗絲 (thick filament)。肌球蛋白也存在于非肌肉細(xì)胞內(nèi)。 在骨骼肌中與粗絲緊密締合在一起的是細(xì)絲 (thin filament)，它由 肌動(dòng)蛋白 組成。肌動(dòng)蛋白以兩種形式存在，球狀肌動(dòng)蛋白(G— 肌動(dòng)蛋白 )和纖維狀肌動(dòng)蛋白 (F— 肌動(dòng)蛋白 )。纖維狀肌動(dòng)蛋白實(shí)際上是一根由 G— 肌動(dòng)蛋白分子 (分子量為 46000)締合而成的細(xì)絲。兩根 F— 肌動(dòng)蛋白細(xì)絲彼此卷曲形成雙股繩索結(jié)構(gòu)。 肌肉收縮過(guò)程 免疫球蛋白 ? 免疫球蛋白是一類 血漿糖蛋白 (serum glycoprotein)。糖蛋白中的蛋白質(zhì)與糖是共價(jià)聯(lián)接的。 ? 免疫球蛋白是被脊椎動(dòng)物作為抗體合成的。它的合成場(chǎng)所是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞。這些細(xì)胞分布在脾、肝和淋巴節(jié)等組織中。 ? 當(dāng)一類外來(lái)的被稱為抗原的物質(zhì)，如多糖、核酸和蛋白質(zhì)等侵入機(jī)體時(shí)即引起抗體的產(chǎn)生，這就是所謂免疫反應(yīng)。 抗體就是免疫球蛋白。 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) 免疫球蛋白 G ? 人的免疫球蛋白可分為 五大類 ，其分子量范圍從150000到 950000道爾頓。免疫球蛋白 M(IgM)是對(duì)一個(gè)抗原作出反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的第一個(gè)抗體。 ? 免疫球蛋白 G(IgG)是一類最簡(jiǎn)單的免疫球蛋白。 IgG含有兩條相同的高分子量的重鏈 (heavy chain)和兩條相同的低分子量的輕鏈 (light chain)。 ? 四條鏈通過(guò)二硫鍵共價(jià)聯(lián)接成 Y字形 結(jié)構(gòu)。每一免疫球蛋白分子含有二個(gè)抗原結(jié)合部位，它們位于 Y形結(jié)構(gòu)的二個(gè)頂點(diǎn)。 立體結(jié)構(gòu)模型 抗體的特點(diǎn) ? 抗體具有兩個(gè)最顯著的特點(diǎn) ， 一是高度特異性 ，二是多樣性 。 ? 高度特異性就是一種抗體一般只能與引起它產(chǎn)生的相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng) 。 抗原 — 抗體復(fù)合物往往是不溶的 ， 因此常從溶液中沉淀出來(lái) ， 此即 “ 沉淀反應(yīng) ” 。 在體外 ， 沉淀反應(yīng)已被廣泛用于研究抗原 — 抗體反應(yīng) ， 并成為免疫學(xué)的基礎(chǔ) 。 多樣性就是它們可以和成千上萬(wàn)的各種抗原 (天然的和人工的 )起反應(yīng) 。 ? — 般說(shuō)來(lái) ， 一個(gè)抗原與接受該抗原的動(dòng)物關(guān)系愈遠(yuǎn) ， 則產(chǎn)生抗體所需的時(shí)間愈短 ， 抗體反應(yīng)也愈強(qiáng) 。 抗原 ? 某些低分子量的物質(zhì)可以與抗體結(jié)合，但它們本身不能刺激抗體的產(chǎn)生。如果它們與大分子緊密結(jié)合，則能刺激抗體的產(chǎn)生。這些小分子物質(zhì)稱為半抗原 (hapten)。 ? 幾乎所有外來(lái)的蛋白質(zhì)都是抗原，并且每種蛋白質(zhì)都能誘導(dǎo)特異抗體的產(chǎn)生。一個(gè)人得體內(nèi)在任一個(gè)給定時(shí)刻大約有 10000種抗體存在。 下課了！