【正文】 2. 用 MEM培養(yǎng)基洗滌單層細(xì)胞一次。 3. 在 5ml聚丙乙烯試管中加入下列試劑 ml無血清的 MEM培養(yǎng)基 50 181。l Lipofectin， 1mg/ml GIBCO BRL產(chǎn)品 在另一只聚丙乙烯試管中加入 ml 無血清的 MEM培養(yǎng)基 50 181。l DNA或 RNA 5～ 19181。g 在加入每一項(xiàng)后混勻。 4. 吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基。 5. 將兩只試管內(nèi)的溶液合并，并用移液管抽吸混勻。 6. 將上述液體小心吸取 3 ml轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿上，注意不要破壞細(xì)胞層。 7. 在 37℃ 將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。 8. 次日早晨，吸去舊培養(yǎng)基，并加入含 20%小牛血清的 MEM培養(yǎng)基。 9. 繼續(xù)培養(yǎng) 48～ 72小時(shí)，而后收集細(xì)胞用于抽提及下步實(shí)驗(yàn)。 注意問題 1. 目前許多分子生物學(xué)公司均生產(chǎn)不同的產(chǎn)品用于陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。如 GIBCO BRL公司的 Lipofectin和Boehringer Mannheim 公司的 DOTAP。 2. 不必用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。在配制脂質(zhì)體－核酸混合液時(shí)必須使用無血清的培養(yǎng)基。因?yàn)檠蹇梢砸种坪怂崤c脂質(zhì)體之間的相互作用。 3. 為了取得最佳轉(zhuǎn)染效果，對(duì)于 Lipofectin的用量，核酸用量以及細(xì)胞與 Lipofectin和核酸復(fù)合物共同保溫時(shí)間的最佳長度等問題，都必須根據(jù)不同的細(xì)胞株而決定。 TA克隆系統(tǒng)由 Invitrogen公司發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。 TA克隆是一種一步到位的把 PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的方法。 TA克隆系統(tǒng)利用熱穩(wěn)定的 TaqDNA聚合酶在 DNA雙鏈分子的 3’ 末端加上一個(gè)腺苷酸。這個(gè) 3’ A突出端被用于把 PCR產(chǎn)物直接插入到有一個(gè) 3’ T突出端的載體。制備好的載體，其關(guān)鍵部分是帶有 3’ T突出端的線形分子。 PCR產(chǎn)物的 TA克隆 PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物在任何情況下都可用于 TA克隆，但是帶有3’ 至 5’ 外切酶活性的聚合酶應(yīng)盡量不用，這是因?yàn)榭寺〉男蕵O低。除非 PCR產(chǎn)物是多種系的，否則一般沒有必要純化 PCR產(chǎn)物。 連接 ddH2O 5181。l 10 連接緩沖液 1181。l PCR載體 2181。l PCR產(chǎn)物 1181。l T4 DNA連接酶 1181。l 12 ℃ 保溫 4～ 12小時(shí)。 轉(zhuǎn)化 ⑴ 在冰上融化 –巰基乙醇和一小管感受態(tài)細(xì)胞，體積約 為 100181。l。 ⑵ 加 2181。l mol/L β –巰基乙醇于細(xì)胞中并輕輕敲打使之混合。 ⑶ 加 1181。l連接混合物于細(xì)胞中，輕輕敲打。 ⑷ 冰浴 30分鐘。 ⑸ 42℃ 保溫 30秒，并把小管置于冰上 2分鐘。 ⑹ 加 450181。l預(yù)熱的 SOC培養(yǎng)基于小管中， 225rpm/min 37℃ 振蕩培 養(yǎng) 1小時(shí)。 ⑺ 鋪 25181。l XGal（ 40 mg/ml, 溶于 DMSO中）和 5181。l IPTG ( 200mg/ml)于 LB平 板之上，并等 30分鐘。 ⑻ 鋪 25181。l和 100181。l轉(zhuǎn)化混合物于分離平板上。 ⑼ 37℃ 倒置培養(yǎng) 20～ 40小時(shí)。 ⑽ 挑選白色的菌落進(jìn)行質(zhì)粒電泳分析和限制性酶切分析， PCR擴(kuò)增 以及測序。藍(lán)色菌落是無插入片段的載體。 PCR產(chǎn)物的鑒別 PCR載體大小為 ?？寺^(qū)含有許多限制性酶切位點(diǎn)。載體也 包含有 M13正向引物和反向引物位點(diǎn)。所以用于 PCR擴(kuò)增的引物及用于這種載體的引物都能應(yīng)用于測序和 PCR鑒別。從篩選出的克隆中提取質(zhì)粒，然后用下面的方法來區(qū)分插入片段是否為 PCR產(chǎn)物。 ⑴ 限制性內(nèi)切酶切分析。 Hind III 和 EcoR I對(duì)載體的酶切可以釋放 PCR 產(chǎn)物片段。 PCR產(chǎn)物片段也可以用其它限制性內(nèi)切酶酶切 分析。 ⑵ 帶有 PCR引物的重組載體的 PCR擴(kuò)增應(yīng)能產(chǎn)生同樣大小的產(chǎn)物。 ⑶ 用于載體的引物和應(yīng)用于 PCR擴(kuò)增的引物都能對(duì)插入片段進(jìn)行測序 分析。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 把外源基因?qū)雱?dòng)物的受精卵，再將這一受精卵接種到寄養(yǎng)雌性動(dòng)物， foster mother的子宮內(nèi)，使之發(fā)育繁殖。 這時(shí)外源基因與動(dòng)物本身的基因整合，外源基因就能隨細(xì)胞分裂而增殖， 在體內(nèi)得到表達(dá)，并能傳給下一代。 這樣培育的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。最早完成的是轉(zhuǎn)基因小鼠 。 雌性鼠（卵） 雄性鼠（精子） → 受精卵 → 從輸卵管洗出 → 用顯微注射法在前核內(nèi)注入感興趣的異體DNA → 把卵細(xì)胞移植于借腹懷孕的雌性小鼠 → 雌性小鼠產(chǎn)生多胎新生小鼠 → DNA分析鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠 顯微注射法 將克隆的異體基因注入受精卵 受精卵 2個(gè)前核， Pronucleu, 一個(gè)來自精子，一個(gè)來自卵細(xì)胞。 2Pl 體積的溶液（含幾百個(gè)拷貝），直接注入一個(gè)前核內(nèi)。 受精卵 → 移入寄養(yǎng)雌性動(dòng)物的輸卵管內(nèi) → 子宮內(nèi)著床 → 發(fā)育成熟 轉(zhuǎn)基因小鼠， transgenic mice攜帶異種 DNA的小鼠 轉(zhuǎn)基因 transgene異種 DNA 轉(zhuǎn)基因家兔，豬，羊 轉(zhuǎn)入的基因是生長激素（ hGH） 觀察方法 ⑴ 檢測 hGH mRNA 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)并 可測量 hGH的產(chǎn)生。 ⑵ 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本身的增大來觀察 hGH是否表達(dá)。 成功率低 2022個(gè)注射卵，只有一個(gè)卵產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 轉(zhuǎn)基因牛 1000個(gè)受精卵， 129個(gè)發(fā)育成胚胎，產(chǎn)生 19個(gè)牛 仔， 2頭含組入基因組中的異體 DNA。