遺傳工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)(已修改)
2025-09-23 21:43 本頁面
【正文】 DNA重組技術(shù)的應(yīng)用 重組蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng) ? 克隆能編碼特定蛋白質(zhì)的基因或 cDNA. ? 開發(fā)合適的表達系統(tǒng) 常用的表達系統(tǒng) 1. 大腸桿菌 2. 枯草芽孢桿菌 Bacillus Subtilis 3. 酵母 4. 培養(yǎng)的昆蟲細胞 5. 哺乳動物細胞 選擇表達系統(tǒng)，根椐所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的性狀確定。 細菌細胞 優(yōu)越性 1. 操作方便 2. 細菌繁殖快 3. 可獲得大量蛋白質(zhì)且價格低廉 缺點 1. 多肽成份常不能適當(dāng)?shù)恼郫B，常形成不溶性包涵體。而從包涵體中制備的蛋白質(zhì)常無生物活性。 2. 菌體因產(chǎn)生的大量異體蛋白，而對細菌產(chǎn)生毒性副作用，而使細菌培養(yǎng)物中細菌的濃度不高。 3. 細菌缺乏轉(zhuǎn)錄后修飾的酶，如在蛋白質(zhì)上加上磷酸根，糖基。而這些修飾作用對蛋白質(zhì)完成其功能常常是必須的。 酵母細胞 優(yōu)越性 1. 為十分簡單的真核細胞，其特性和哺乳動物細胞相似，而其生長和細菌一樣快。 2. 可完成人類蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾。并可誘導(dǎo)表達蛋白分泌至培養(yǎng)基中。 缺點 其有活性的蛋白水解酶類，可降解異體蛋白，使其產(chǎn)量降低。 昆蟲細胞 利用昆蟲病毒，桿狀病毒在昆蟲細胞中表達異體蛋白質(zhì)。 優(yōu)越性 ，多肽能正確折疊。 。 缺點 昆蟲細胞培養(yǎng)價格高于細菌和酵母 哺乳動物細胞 生產(chǎn)哺乳動物蛋白質(zhì)的最佳表達系統(tǒng)。 啟動子，載體，轉(zhuǎn)染方法 在哺乳動物細胞穩(wěn)定組入擴增基因，可供產(chǎn)生大量蛋白 缺點 細胞培養(yǎng)價格高于細菌和酵母和昆蟲細胞。 啟動子 可使克隆的外源基因高水平表達的最佳啟動子，必須具備后面這幾個條件 1. 它必須是一種強啟動子，能夠使克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達 量占細胞總蛋白的 10％～ 30％以上。 2. 這個啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平。 3. 這種啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。 如在大批量的蛋白質(zhì)制備中，熱和化學(xué)誘導(dǎo)便是兩種廣泛使用的方式。 IPTG是雜種強啟動子 tac和 trc的一種有效的化學(xué)誘導(dǎo)物。但對于人類臨床藥用蛋白質(zhì)的大批量制備， IPTG則不是理想的誘導(dǎo)物，因為它有毒性。 編碼熱敏感 lac阻遏物的溫度敏感突變體 lacI基因，為誘導(dǎo) 1ac及其派生啟動子提供了方便的手段。 tac的一 10和一 35元件之間有一段 17bp的間隔序列。 ,RBS 由 Shine—Dalgarno,SD序列及其后的一段富含 AT堿基的轉(zhuǎn)譯間隔區(qū)組成， 間隔區(qū)的 最適長度約為 8個堿基。 ， SD序列與 16srRNA的 3末端發(fā)生作用。 。三個終止密碼子中其后連著 U的 UAA是大腸桿菌最有效的轉(zhuǎn)譯終止密碼子。 1. 調(diào)節(jié)基因 R 編碼阻遏物，可調(diào)節(jié)啟動子的活性，它既可以存在于表達載體上，也可以是整合在寄主染色體上。 2. 轉(zhuǎn)錄終止子， TT 可使 mRNA和載體分子穩(wěn)定?？咕乜剐曰?， ter為載體提供了表型選擇記號，復(fù)制起點， 0ri決定著載體的拷貝數(shù)。 克隆載體 克隆質(zhì)粒載體 基因克隆的目的不僅是為了獲得大量的克隆在載體上的 DNA 片段，而且還要考慮后續(xù)實驗如測序，表達，突變的要求。 pGEMT和 pGEMT Easy載體 1. PCR擴增中常用的 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶可以不需要模板在 PCR產(chǎn)物上加一個 A，一些生物公司根據(jù)這一特點研究制了 T載體。 2. 在 pGEMT載體的兩邊還分別有一個限制性內(nèi)切酶 BstZ I的識別位點，如果在外源 DNA片段上沒有該酶的識別位點，只用該酶就可以將外源基因完整的切下來，根據(jù)酶切片段的大小對重組質(zhì)粒進行簽定。在 pGEMT Easy質(zhì)粒的插入點兩邊，增加了 EcoR I和 Not I酶切位點，使外源 DNA片段的鑒定更加容易。 表達質(zhì)粒載體 1. 原核表達質(zhì)粒載通常須具有一個強的啟動子，一個位于啟動子和起始密碼子 ATG之間的核糖體結(jié)合序列以及位于外源基因插入序列下游的轉(zhuǎn)錄終止序列。 2. 原核表達載體常用的啟動子 ? lac啟動子 較早使用的啟動子，來自大腸桿菌的乳糖操縱子，常用 IPTG誘導(dǎo)，啟動外源基因的表達。 ? trp啟動子 來自大腸桿菌的色氨酸操縱子，表達載體上的啟動子常常包含操縱子的啟動基因，操縱基因和部分 trpE基因，刪除了衰減子序列，在 β 吲哚丙氨酸的誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄水平比大腸桿菌中的正常啟動子提高 8到 10倍。 ? tac啟動子 是一組由 lac和 trp啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子，但仍可以用 IPTG誘導(dǎo)，tac是一個非常強的啟動子，由 tac啟動子啟動的基因的轉(zhuǎn)錄水平比 lac和trp啟動子高。 ? PL啟動子 來自 λ 噬菌體，也是一個非常強的啟動子。 受 λ 噬菌體阻遏基因 cI編碼的阻遏蛋白的控制，表達載體的宿主菌帶有一個 cI基因溫度敏感突變體，它表達的阻遏蛋白在 28～30℃ 才有活性，能夠阻抑啟動子的表達；當(dāng)溫度提高到42℃ 時，它的表達產(chǎn)物失去活性，啟動子能夠轉(zhuǎn)錄外源基因。這種溫度誘導(dǎo)的特性是以 PL為表達載體的一大優(yōu)點。 ? T7啟動子 來自于 T7噬菌體，有該啟動子并在 T7 RNA聚合酶驅(qū)動下表達外源基因的大腸桿菌質(zhì)粒稱為 pET表達載體家族。 T7噬菌體 RNA聚合酶不僅能夠選擇性的與 T7啟動子結(jié)合，而且在不降低啟動效率的前題下，其沿 DNA模板合成 mRNA的速度比大腸桿菌 RNA聚合酶快 5 倍，因此提高了對外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。 pET表達系統(tǒng)表達外原蛋白必須使用特殊的大腸桿菌受體菌，如 BL21和 HNS174。 這些菌株是 λ 噬菌體的溶源衍生菌，其染色體上含有 PlacUV5啟動子控制下的 T7 RNA聚合酶基因。 pET表達系統(tǒng)是一個基因表達的級聯(lián)反應(yīng)，
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