【正文】 量需要的物質(zhì)。 發(fā)酵培養(yǎng)基 ? 目的：使接種菌絲生長(zhǎng)并能高效表達(dá)，獲得高的發(fā)酵產(chǎn)量，同時(shí)組分盡可能單一，以保證高的得率。 ? 要求 ? 營(yíng)養(yǎng)豐富完全，有利于產(chǎn)物合成； ? 不能大量加 入速效 C、快 N源，應(yīng) 和遲效 C、 N源相結(jié)合； ? 在產(chǎn)物分泌期間， pH 穩(wěn)定； ? 加入適量合成所需的物質(zhì)，如前體等，進(jìn)行定向發(fā)酵； ? 采用中間補(bǔ)料，以提高發(fā)酵單位； ? 原料的考慮 —— 成本問(wèn)題 76 問(wèn)題來(lái)了！ 交給你一個(gè)菌株，讓你拿出一個(gè)對(duì)該菌株最好的培養(yǎng)基配方，你如何做？ 第四節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原理和優(yōu)化方法 目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來(lái)推斷和計(jì)算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗(yàn)配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。 一、培養(yǎng)基成分選擇的原則 ? 菌種的同化能力 ? 代謝的阻遏和誘導(dǎo) ? 合適的 C、 N比 100∶ ～ ? pH的要求 1 菌體的同化能力 由于微生物來(lái)源和種類的不同，所能分泌的水解酶系不同。 2 培養(yǎng)基對(duì)菌體代謝的阻遏和誘導(dǎo) 80 3 碳源和氮源的濃度和比例 ? 對(duì)于孢子培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，營(yíng)養(yǎng)不能太豐富 (特別是有機(jī)氮源 )，否則不利產(chǎn)孢子； ? 對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)既要利于菌體的生長(zhǎng)，又能充分發(fā)揮菌種合成代謝產(chǎn)物的能力。 ? 碳源與氮源的比例是一個(gè)影響發(fā)酵水平的重要的因素。因?yàn)樘荚醇茸鳛樘技軈⑴c菌體和產(chǎn)物合成又作為生命活動(dòng)的能源， 所以一般情況下，碳源用量要比氮源用量高 。 ? 應(yīng)該指出的是：碳氮比也隨碳源和氮源的種類以及通氣攪拌等條件而異，因此很難確定一個(gè)統(tǒng)一的比值。 81 ? 碳氮比偏小，菌體生長(zhǎng)旺盛，但易造成菌體提前衰老自溶，影響產(chǎn)物的積累； ? 碳氮比過(guò)大，菌體繁殖數(shù)量少，不利于產(chǎn)物的積累。 ? 碳氮比合適，但碳源和氮源濃度偏高，會(huì)導(dǎo)致菌體的大量繁殖，發(fā)酵液黏度增大，影響溶解氧濃度，容易引起菌體的代謝異常，影響產(chǎn)物合成。 ? 碳氮比合適，但碳源和氮源濃度過(guò)低，會(huì)影響菌體的繁殖，同樣不利于產(chǎn)物的積累。 82 ? 在四環(huán)素發(fā)酵中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比維持在 25:1時(shí)，四環(huán)素產(chǎn)量較高。 ? 除此以外，對(duì)于一些快速利用的碳源和氮源， 要避免濃度過(guò)高導(dǎo)致的分解產(chǎn)物阻遏作用 。 ? 如葡萄糖濃度過(guò)高會(huì)加快菌種的呼吸，使培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足菌體生長(zhǎng)的需要，葡萄糖分解代謝進(jìn)入不完全氧化途徑，一些酸性中間代謝產(chǎn)物會(huì)累積在菌體或培養(yǎng)基中，使 pH降低，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。 83 4 生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)的比例 ? 生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)的用量也要適當(dāng)，否則會(huì)引起發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的 pH大幅度波動(dòng)，影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。 ? 因此，要根據(jù)菌種 ? 在現(xiàn)有工藝和設(shè)備條件， ? 生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物時(shí) pH的變化情況 ? 最適 pH的控制范圍 (一般霉菌和酵母菌比較適于 微酸性環(huán)境 ，放線菌和細(xì)菌適于 中性或微堿性環(huán)境 ) ? 綜合考慮生理酸堿物質(zhì)及其用量，從而保證在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中 pH都能維持在最佳狀態(tài)。 （一）、 理論轉(zhuǎn)化率與實(shí)際轉(zhuǎn)化率 理論轉(zhuǎn)化率是指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進(jìn)行物料衡算，所得出的轉(zhuǎn)化率的大小。 實(shí)際轉(zhuǎn)化率是指實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)化率的大小 如何使實(shí)際轉(zhuǎn)化率接近于理論轉(zhuǎn)化是發(fā)酵控制的一個(gè)目標(biāo) 二、成分含量的確定 例 : 如在酒精生產(chǎn)中葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論轉(zhuǎn)化率計(jì)算如下 ∶ 葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的代謝總反應(yīng)衡算式為 ∶ C6H12O6 ─→ 2C 2H5OH + 2CO2 葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論得率為 ∶ 2*46 Y = ─── = 176 （二）、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ? 培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的 ? 合理的實(shí)驗(yàn)方法 ?多因子實(shí)驗(yàn)：均勻設(shè)計(jì)、 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、 響應(yīng)面分析等。 ?多因子實(shí)驗(yàn) ③ 當(dāng)培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問(wèn)題就是各成分最適 的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)常采 用一些合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。 三、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的步驟 ① 根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)基成分確定時(shí)一些必須考慮 的問(wèn)題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分； ② 通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分； 正交 實(shí)驗(yàn) 均勻 設(shè)計(jì) 神經(jīng) 網(wǎng)絡(luò) 其他 方法 聚類 分析 響應(yīng)面 分析 單因子 實(shí)驗(yàn) 成本 發(fā)酵單位 方法 結(jié)果 培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法 類胡蘿卜素高產(chǎn)菌 Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化 郭秒 ,食品與工業(yè)發(fā)酵， 2022 類胡蘿卜素的作用：色素、營(yíng)養(yǎng)保健 原培養(yǎng)基 : ? 通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)確定適宜的培養(yǎng)基成分 (以碳源為例 ) 考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源 進(jìn)一步：乙酸鈉的濃度 2%比較好 結(jié)果： 碳源：乙酸鈉 0. 2% 氮源：氯化銨 % 酵母膏 % 無(wú)機(jī)鹽 : 復(fù)合無(wú)機(jī)鹽 % ? 正交設(shè)計(jì)確定優(yōu)化的配方 改進(jìn)后培養(yǎng)基 原培養(yǎng)基 改進(jìn)后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基配方 確定主要因素 PlackettBurman設(shè)計(jì)法 PlackettBurman設(shè)計(jì) ? PlackettBurman試驗(yàn)就是篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要針對(duì)因子數(shù)較多，且未確定眾因子相對(duì)于響應(yīng)變量的顯著影響，采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。方法主要通過(guò)對(duì)每個(gè)因子取兩水平來(lái)進(jìn)行分析，通過(guò)比較各個(gè)因子兩水平的差異與整體的差異來(lái)確定因子的顯著性。篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能區(qū)分主效應(yīng)與交互作用的影響，但對(duì)顯著影響的因子可以確定出來(lái)，從而達(dá)到篩選的目的，避免在后期的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源。 近飽和的 2水平設(shè)計(jì)方法，高水平取低水平的 ，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。用統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù) PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選主要因素，進(jìn)一步用 爬坡試驗(yàn) 逼近最佳值。 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基配方 確定實(shí)驗(yàn)點(diǎn) 根據(jù) BoxBenhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。確定最佳實(shí)驗(yàn)點(diǎn)和預(yù)測(cè)最佳響應(yīng)值。 響應(yīng)面分析 ? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化方法，都未能給出直觀的圖形，因而也不能憑直覺(jué)觀察其最優(yōu)化點(diǎn)，雖然能找出最優(yōu)值，但難以直觀地判別優(yōu)化區(qū)域．為此響應(yīng)面分析法（也稱響應(yīng)曲面法）應(yīng)運(yùn)而生．響應(yīng)面分析也是一種最優(yōu)化方法，它是將體系的響應(yīng)（如發(fā)酵過(guò)程中的工藝條件）作為一個(gè)或多個(gè)因素（如基質(zhì)濃度、酸度等）的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來(lái)，以供我們憑借直覺(jué)的觀察來(lái)選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件． 數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)在培養(yǎng)優(yōu)化中的應(yīng)用， 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基 四、搖瓶水平到反應(yīng)器水平的優(yōu)化配方 搖瓶、反應(yīng)器培養(yǎng)基研究的兩個(gè)層次 ? 搖瓶 —— 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的第一步 ? 反應(yīng)器 — 最終的優(yōu)化的基礎(chǔ)配方 例： 青霉素發(fā)酵 發(fā)酵搖瓶： 玉米漿 4%，乳糖 10%， (NH4)SO4 % 輕質(zhì)碳酸鈣 1% 發(fā)酵罐 :葡萄糖流加控制總量 1015%，玉米漿總量 48% 補(bǔ)加硫酸、前體等 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)差別很大 搖瓶?jī)?yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ) 發(fā)酵罐：反應(yīng)器水平 ,可以得出最終優(yōu)化的基礎(chǔ)配方 pH控制搖床：反應(yīng)器水平上的搖瓶研究 五、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí)注意的一些相關(guān)問(wèn)題 ? 原料及設(shè)備的預(yù)處理 ? 原材料的質(zhì)量 ? 發(fā)酵特性的影響 在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中往往喜歡所謂的 “ 稀配方 ” ，因?yàn)樗冉档统杀?、滅菌容易、且使氧傳遞容易而有利于目的產(chǎn)物的生物合成。如果營(yíng)養(yǎng)成分缺乏，則可通過(guò)中間補(bǔ)料方法予以彌補(bǔ)。 ? 滅菌 在大規(guī)模發(fā)酵中應(yīng)該盡可能的采取連續(xù)滅菌的操作，而且保證滅菌條件的穩(wěn)定是保證發(fā)酵穩(wěn)定的前提 有時(shí)避免營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在加熱的條件下，相互作用，可以將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分開(kāi)消毒。 有些物質(zhì)由于揮發(fā)和對(duì)熱非常敏感，就不能采用濕熱的滅菌方法 Na2HPO4+CaCO3→CaHPO 4+Na2CO3