分離工程第六章ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-09-11 18:20本頁(yè)面
【正文】 水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。 ? 親水性蛋白質(zhì)表面均含有一定量的疏水性基團(tuán)，可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短鏈烷基、苯基等弱疏水基發(fā)生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附劑）所吸附。 疏水作用層析 (Hydrophobic Interaction Chromatography） Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity 操作： ? 與 IEC不同，蛋白質(zhì)的吸附在高濃度鹽溶液中進(jìn)行，洗脫則主要采用降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。 ? 原因：根據(jù)蛋白質(zhì)鹽析沉淀原理，在離子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，疏水性相互作用增大。所以，蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑上的分配系數(shù)隨流動(dòng)相鹽濃度（離子強(qiáng)度）的提高而增大。 二、疏水性吸附劑 各種凝膠過(guò)濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。 常用的疏水性配基主要有：苯基、短鏈烷基（ C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 因疏水性吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長(zhǎng)度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，一般為10~40?mol/cm3，過(guò)小則疏水性吸附作用不足，過(guò)大則洗脫困難。 強(qiáng)烈的洗脫條件，會(huì)使被洗脫的蛋白質(zhì)變性?？筛鶕?jù)系列柱實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷蛋白質(zhì)表面的疏水性質(zhì)。從而決定分辨和純化蛋白質(zhì)的方案。 Mechanism of HIC 疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基的結(jié)合或醚鍵結(jié)合。 － NH－ R－ NH2 － NH－ R － O－ CH2CHCH2OR ∣ OH 其中： R＝－ (CH2)nCH3， n=2~7；或 R＝ R表示疏水性配基。 三、應(yīng)用及特點(diǎn) 應(yīng)用 ? HIC基于疏水性吸附分離純化蛋白質(zhì)類生物大分子，與 IEC的離子交換作用完全不同，可與 IEC互補(bǔ)短長(zhǎng)，分離純化利用IEC難于分離的蛋白質(zhì)。 特點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn) ?由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此 HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液； ?通過(guò)改變疏水配基鏈長(zhǎng)和密度可調(diào)節(jié)吸附力，因此可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑； ?疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價(jià)格與離子交換劑相當(dāng)。 ? 缺點(diǎn) ? 由于疏水性相互作用機(jī)理比較復(fù)雜，吸附劑的選擇和洗脫分離條件不易掌握。 ? 較高鹽濃度下，疏水作用色層分離法難以得到很好的分辨率。 ? 水中溶解度較差蛋白如球蛋白、膜結(jié)合蛋白低鹽濃度也能很強(qiáng)地吸附，用疏水作用層析也難將它們分離。 思考題：簡(jiǎn)述疏水性相互作用層析用于蛋白質(zhì)分離的原理和操作。 填空題 DEAE纖維素是一種 —— 交換劑，CM纖維素是一種 —— 交換劑。 一個(gè)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)可牢固地結(jié)合到陰離子交換劑上，因此需要一種比原來(lái)緩沖液 pH值 —— 和離子強(qiáng)度 —— 的緩沖液，才能將此蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。 選擇題 進(jìn)行疏水吸附層析時(shí)，以下哪種條件比較合理（ ） （ A）在有機(jī)溶劑存在時(shí)上柱，低鹽溶液洗脫 （ B）在有機(jī)溶劑存在時(shí)上柱，高鹽溶液洗脫 （ C）低鹽條件下上柱，高鹽溶液洗脫 （ D）高鹽溶液上柱，按低鹽、水和有機(jī)溶劑順序洗脫 （ E）低鹽條件上柱，低鹽洗脫 回答題 用增加鹽離子強(qiáng)度的方法，從指定的離子交換柱上洗脫下列蛋白質(zhì)，指出它們被洗脫下來(lái)的先后順序，并說(shuō)明理由。已知細(xì)胞色素 C的 pI=，溶菌酶 pI=，卵清蛋白 pI=，肌紅蛋白pI=，胃蛋白酶 pI=，脲酶 pI=，血紅蛋白 pI=。 （ 1）細(xì)胞色素 C，溶菌酶，卵清蛋白，肌紅蛋白（陰離子交換柱）； （ 2）細(xì)胞色素 C，胃蛋白酶，脲酶，血紅蛋白（陽(yáng)離子交換柱） 在一種抽提液中含有三種蛋白質(zhì)，其性質(zhì)如下： 蛋白質(zhì) 相對(duì)分子量 等電點(diǎn) A 20220 B 21000 C 5000 試設(shè)計(jì)一個(gè)方案來(lái)分離純化這三種蛋白質(zhì)。 同學(xué)們辛苦了！ 本章內(nèi)容到此結(jié)束
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