【正文】 ? 急性肺損傷 /急性呼吸窘迫綜合癥：是在致病因子的作用下發(fā)生的過度炎癥反應，細胞因子 TNF,IL8， IL1β 等在其發(fā)生發(fā)展中都起了重要的作用。 ? 其它如重癥肌無力、 2型糖尿病、動脈粥樣硬化、結核病、骨關節(jié)病等都與細胞因子密切相關。 細胞因子的檢測 ? 用于判斷機體免疫功能，進行疾病輔助診斷，判斷病程，預后，評價治療效果 細胞因子檢測常用方法 ? 生物活性檢測法 (biossay)檢測細胞因子的生物學活性 ? 免疫學檢測法 (immnuossay)檢測細胞因子蛋白質的抗原特性 ? 分子生物學檢測法 檢測細胞因子的 mRNA表達 生物 活性 檢測法 ? 增殖實驗 ： 應用某一細胞因子能特異刺激或抑制某些指示細胞的增殖 ,通過 [3H]TdR攝入 ,MTT,反應待測細胞因子的活性水平 。 ? 集落形成實驗 ： 半固體培養(yǎng)系統(tǒng) ,造血因子集落刺激因子誘導干細胞形成某一或某些種類的集落 . ? 直接殺傷靶細胞 ： [3H]TdR、 51Cr釋放法 ? 抗病毒活性 ： 干擾素抑制病毒致病變的程度 ,計算樣品中 IFN的活性單位 ? 凋亡實驗： 各種試劑盒、流式細胞儀 ? 趨化實驗 ： 瓊脂糖中的趨化實驗、微孔小室趨化實驗 ? 遷移、侵襲實驗 ：劃痕試驗、 transwell 細胞增殖常用方法 3Hthymidine incoroperation 法 將 PBMC 2 106/ml 置於 96well plate, 再加入 RPMI 培 養(yǎng) 基或添加有 LPS (lipopolysaccharide) , Con A, PHA, PWM 等 細 胞絲 裂 原 的培基。於 37℃ CO2 培 養(yǎng) 箱 2天後，加入 1 μCi/well 3H胸腺嘧啶（ thymidine） ， 繼續(xù)培養(yǎng) 8小 時后 ，以 cell harvester 收集 細 胞 于濾紙 上， 風干后 以 閃爍計數(shù)儀測 3Hthymidine 含量， 計算細胞增殖 能力。 MTT法基本可以替代。 ? Cell Counting Kit8簡稱 CCK8試劑盒，是一種基于 WST8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。 WST8是一種類似于 MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的 formazan (參考圖 1)。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系 。 ? Transwell ? 將 Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內稱上室，培養(yǎng)板內稱下室，上室內盛裝上層培養(yǎng)液，下室內盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響 。 ? 腫瘤細胞遷移實驗 、 ，上室種腫瘤細胞，下室加入 FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。 ? 腫瘤細胞侵襲實驗 ? 、 ，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。 ? transwell侵襲實驗，原理簡單地說就是用一層膜將高營養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開，細胞放在低營養(yǎng)的培養(yǎng)液里，為了找吃的，細胞會往高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑，但是有膜擋著，所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上一層基質膠，模仿細胞外基質，于是細胞要把基質消化了才可以從低營養(yǎng)的培養(yǎng)液跑到高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面，最后我們檢測高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了 。 免疫學檢測法 (1) ?可溶性細胞因子檢測 : – 放射免疫測定（ RIA） 特異 Ab包被 +待測樣品和同位素標記的細胞因子 竟爭抑制實驗 – 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ ELISA） 雙抗體加心法 – Western Blot – 檢測單個細胞分泌的細胞因子：細胞斑點、酶聯(lián)斑點 免疫學檢測法 (2) ? 細胞內和細胞膜上的細胞因子的研究 – 檢測單個細胞結合的細胞因子：生物素、堿性磷酸酶、免疫熒光 – 檢測細胞內的細胞因子 細胞內的細胞因子的熒光檢測 分子生物學檢測 ? Southern Blot ? Northern Blot ? 原位雜交 ? RTPCR 體內功能研究 ? 基因敲除、轉基因 ? 利用特異性抗體觀察細胞因子在體內的生物學作用 細胞因子的應用 ? 在臨床治療： ? 重組細胞因子： – 抗腫瘤細胞因子： IL IFNa – 促進造血的細胞因子： GCSF、 GMCSF、 EPO、 IL11 – 最近發(fā)現(xiàn)細胞因子可以增強化療藥治療白血病的療效。 ? 阻斷和拮抗 – IL1RA， TNF單抗，可溶性 TNFR 生物佐劑： 增強抗原性 ? C I K細胞制備方法 ： ? 取患者自體外周血 2 0 ml ，分離單個核細胞，置含 γ 干擾素、 IL2 、抗 CD3單抗的完全 1640培養(yǎng)液中，第 l 0 d ～ 1 3 d細菌霉菌培養(yǎng)陰性收獲細胞，洗滌后制備成細胞懸液用于治療。 細胞因子的臨床應用舉例 重組細胞因子 ： IFNα 治療肝炎； GMCSF,GCSF治療白細胞減少。 細胞因子抑制劑： （ 1）可溶性細胞因子受體 , 可溶性 TNFα 受 體治療 RA類風濕性關節(jié)炎 (RA) ； （ 2）細胞因子抑制物 , IL1受體拮抗劑（ IL1ra） 治療類風濕關節(jié)炎 （ 3）抗細胞因子或細胞因子受體抗體，抗 TNFα 治療 RA。 ： DAB389IL2免疫毒素治療 T細胞淋巴瘤 已批準上市的 重組 細胞因子藥物 IFNα 白血病、 Kaposi肉瘤、肝炎、癌癥、 AIDS IFNγ 慢性肉芽腫、生殖器疣、過敏性皮炎、類風濕關節(jié)炎 GCSF 自身骨髓移植、化療導致的粒細胞減少癥、 再生障礙性貧 血 GMCSF 自身骨髓移植、化療導致的血細胞減少癥、 再生障礙性貧血 Epo 慢性腎衰導致貧血、癌癥或癌癥化療導致的貧血 、 失血后貧血 IL2 癌癥、免疫缺陷、疫苗佐劑 IFNβ 多發(fā)性硬化癥 IL11 放化療所致血小板減少癥 SCF 與 GCSF聯(lián)合應用與外周血干細胞移植 EGF 外用藥治療燒傷、潰瘍 bFGF 外用藥治療燒傷、外周神經(jīng)炎 FDA批準上市的細胞因子 抑制劑 ? 美國 FDA2022年 11月批準上市的 IL1ra（ Kineret），治療類風濕關節(jié)炎 治療： 炎癥和自身免疫??； T細胞淋巴瘤、白血病； 移植排斥等 白喉毒素片段（ 389aa） IL2 治療 T細胞淋巴瘤的細胞因子免疫毒素 DAB389IL2結構示意圖 我國已批準進入臨床的基因治療項目： P53腺病毒治療腫瘤（批準上市） IX因子基因治療血友病 缺失突變腺病毒（ H101）治療腫瘤 VEGF裸 DNA治療梗塞性外周血管病 TK基因治療惡性腦膠質瘤 IL2基因瘤苗治療胃癌 XSCID的 IL2受體 ?鏈基因治療（ 2022年法國報道 2例，迄今 11例， 10例成功）。但 2022年發(fā)現(xiàn) 2例出現(xiàn)白血病 , 基因均整合至癌基因 LMO2。 Yrina Rochman et al. Nature Bubbleboy (IL2R的 γ鏈缺陷引起 SCID) XSCID 基因治療原理 表達細胞因子 VEGF的腺病毒或裸 DNA直接體內注射 治療梗塞性血管病 細胞因子佐劑 細胞因子在免疫應答的產(chǎn)生和調節(jié)中具有重要作用，可作為免疫佐劑增強疫苗的免疫效果。近年來，重組質粒表達的細胞因子在核酸疫苗研究領域引起了人們廣泛的興趣與關注。 核酸疫苗通常比復制性完整的病原體的免疫原性差，需要多次免疫才能使動物得到有效保護。為了提高這類疫苗的效率，人們嘗試了許多方法。正如傳統(tǒng)疫苗可通過添加佐劑來增加其免疫作用一樣，基因工程疫苗也可通過添加佐劑來達到增強免疫作用的目的。人們最感興趣之一的便是細胞因子。 ? 1 增強細胞免疫反應的細胞因子 ? IFNγ ， IL2， IL12， IL15或 IL18會降低 IgGl/IgG2的比例，顯示 Thl傾向性，同時加強遲發(fā)型超敏反應（ delayed type hypersensitivity,DTH） 和升高 CTL反應。 ? 2 增強體液免疫反應的細胞因子 ? IL IL6和 IL10與在抗 HIV、 HBV、 HSV核酸疫苗聯(lián)合應用后，均會降低 IgG1/IgG2抗體比例，提高 DTH水平，加強 CTL應答。 ? 3 同時增強細胞免疫和體液免疫反應的細胞因子 ? GMCSF是另外一種新型的免疫佐劑，能誘導分化、增殖和活化多種免疫活性細胞，它不僅可以刺激巨噬細胞的生成，還可以誘導體液免疫和細胞免疫。 ? IL2的功能比較廣泛，對 T細胞和 B細胞， NK、巨噬細胞等都有作用，因此 IL2可通過不同作用環(huán)節(jié)調節(jié)和增強 DNA免疫效應，發(fā)揮佐劑作用。 思考題 （ 2個以上細胞因子）。 。