【正文】 （些）分子標(biāo)記協(xié)同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標(biāo)記連鎖。分子標(biāo)記與性狀之間交換值的大小，即表示目標(biāo)基因與分子標(biāo)記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內(nèi)切酶與分子標(biāo)記組成不同組合進(jìn)行研究。常用的限制性內(nèi)切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標(biāo)記則有幾個甚至上千個。分子標(biāo)記越多，則所構(gòu)建的圖譜就越飽和。構(gòu)建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標(biāo)之一。 二，材料、設(shè)備及試劑一、 材料 基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。 二、設(shè)備 電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendorf管()若干。 三、試劑 限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10酶切緩沖液。 5TBE電泳緩沖液：配方見第一章。 變性液：。 中和液：1mol/LTrisCl, 。 10SSC：配方見第九章。 其它試劑：，Cl, SSC ，ddH2O，Agarose %， 。 二， 操作步驟1. 基因組DNA的酶解 (1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實(shí)驗(yàn),要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。 (2) 在50μl反應(yīng)體系中,進(jìn)行酶切反應(yīng): 5μg基因組DNA 5μl 10酶切緩沖液 20單位（U）限制酶(任意一種) 加ddH2 O, 至50μl (3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應(yīng)過夜。 (4) 取5μl反應(yīng)液,％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。 [注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應(yīng)一定要徹底。 2. Southern轉(zhuǎn)移 （1） ％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。 （2） , 10分鐘。 （3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。 （4） 預(yù)先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10SSC鹽溶液吸印,維持1824小時。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。 （5） 取下尼龍膜, , Cl,SSC,溶液中, 5分鐘。 （6） 將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80℃真空干燥2小時。 （7） 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。 四，注意事項 步驟（2）中脫嘌呤時間不能過長。 除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進(jìn)行操作。 步驟（4）中,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。 有時用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時應(yīng)該試用另一種酶。 實(shí)驗(yàn)八 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆 一， 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)): (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈。 (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對。(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)2535輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。 二， 材料、設(shè)備及試劑 一、材料 不同來源的模板DNA。 二、設(shè)備 移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴(kuò)增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機(jī)。 三、試劑 10PCR反應(yīng)緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L TrisCl, 在25℃下, , ％ Triton X100。 MgCl2 ：25mmol/L。 4種dNTP混合物:。 Taq DNA聚合酶5U/μl。 T4 DNA連接酶及連接緩沖液：配方見實(shí)驗(yàn)五。 經(jīng)SmaⅠ酶切和加dT的pUC質(zhì)粒。 其它試劑：礦物油（石蠟油），1% 瓊脂糖，5TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇和70％ 乙醇。三， 操作步驟 一、PCR反應(yīng) 1. 依次混勻下列試劑 35μl H2 O 5μl 10PCR反應(yīng)緩沖液 4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4種dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA(約1ng) 混勻后離心5秒。 2. 將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數(shù)秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（），混勻后稍離心,加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。 3. 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘, 72℃延伸2分鐘, 循環(huán)35輪,進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。 二、電泳 按實(shí)驗(yàn)二所述,取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。 三、PCR產(chǎn)物的純化 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用TVector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。 （一）酚/氯仿法 TE.。 ,用移液器將上層水相吸至新的小管中. 這樣抽提一次, 可除去覆蓋在表面的礦物油。 :氯仿:異戊醇抽提二次,每次回收上層水相。 95％乙醇,置20℃下30min沉淀。 ,吸凈上清液。加入1ml 70％乙醇,稍離后,。將沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。 四，注意事項, 操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺中進(jìn)行。 、離心管應(yīng)高壓滅菌, 每次吸頭用畢應(yīng)更換, 不要互相污染試劑。 , 應(yīng)短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。 。 實(shí)驗(yàn)九 分子雜交技術(shù) 一， 概 述 互補(bǔ)的核苷酸序列通過WalsonCrick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。 雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交, 即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法。 核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性,因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用,而且在臨床診斷上的應(yīng)用也日趨增多。 二， 材料、設(shè)備及試劑 材料：待標(biāo)記的雙鏈含凹缺339。末端的DNA。 設(shè)備：高速臺式離心機(jī)，水浴鍋等。 試劑： (1)3種不含標(biāo)記的dNTP各為200mmol/L。 (2)合適的限制酶。 (3)[α32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。 (4)Klenow片段(5U/ml)。 (5)10末端標(biāo)記緩沖液:Cl (), , 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。 三，操作步驟一，現(xiàn)以Klenow片段標(biāo)記339。末端為例說明末端標(biāo)記的方法。(1)25μl反應(yīng)體系中用合適的限制酶酶切1μg的DNA。 (2)按下列成分加入試劑并混勻： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10末端標(biāo)記緩沖液 5ml 2mmol/L 3種dNTP 1ml [a32P]dNTP 適量 加水至 50ml (3)加入1單位的Klenow片段,室溫下反應(yīng)30分鐘。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15分鐘。 (5)70℃加熱5分鐘,終止反應(yīng)(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀來分離標(biāo)記的DNA,或用Sephdadex G50柱層析分離標(biāo)記的DNA。 二，幾種常見的雜交 分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據(jù)被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類： (1) Southern雜交:DNA片段經(jīng)電泳分離后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。 (2) Northern雜交:RNA片段經(jīng)電泳后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。 根據(jù)雜交所用的方法,另外還有斑點(diǎn)(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3種固相支持體可用于雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙。不同商標(biāo)的尼龍膜需要進(jìn)行不同的處理，在DNA固定和雜交的過程中要嚴(yán)格按生產(chǎn)廠家的說明書來進(jìn)行。Whatman 541濾紙有很高的濕強(qiáng)度,最早用于篩選細(xì)菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優(yōu)點(diǎn):它更便宜,雜交中更耐用,干燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心,雜交信號的強(qiáng)度會明顯弱于用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強(qiáng)度。因此,常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。 四，注意事項利用本方法可對DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA片段。 對DNA的純度不很嚴(yán)格，少量制備的質(zhì)粒也可進(jìn)行末端標(biāo)記合成探針。 末端標(biāo)記還有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的539。端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用該酶進(jìn)行交換反應(yīng)標(biāo)記539。末端。