【正文】 合phage，洗脫，擴增phage，再結(jié)合；這樣做好幾輪。 Bait蛋白質(zhì)篩表達庫：bait蛋白質(zhì)用同位素、GST、等標記，再篩庫。 蛋白質(zhì)組：這是檢測和鑒定蛋白質(zhì)的方法。不管用什么方法，只要你能得到結(jié)合的蛋白質(zhì)，理論上蛋白質(zhì)組都可以分析。但由于檢測和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質(zhì)間的相互作用都可以被用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和新的相互作用。缺點是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質(zhì)太多常常超出人們的辨別能力和研究能力。2） 發(fā)現(xiàn)相互作用的生物學意義相互作用的證實：不同的發(fā)現(xiàn)相互作用的技術都可以被用來驗證相互作用的蛋白質(zhì)。相互作用的生物學功能：有重要生物學功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。3） 生物學功能的研究功能的獲得：轉(zhuǎn)基因表達，使得原本不表達該蛋白質(zhì)的細胞表達了蛋白質(zhì)，從而和已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，細胞有了新的功能。常用技術：細胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因過表達蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)基因老鼠功能的失去：抑制蛋白質(zhì)的表達或用dominant negative突變體，使原有的蛋白質(zhì)缺失或失活，細胞功能的喪失。常用技術：RNA干擾使蛋白質(zhì)不表達、蛋白質(zhì)部分功能片斷的影響、基因敲除的細胞、基因敲除的老鼠一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術5） 生化方法Traditional copurificationAffinity chromatography(GST pull down)ImmunoprecipitationWestern and FarWestern blota. GST pull down已知蛋白質(zhì)和GST融合，與細胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。GST tag。谷胱甘肽GST fusion proteinGST（谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶）已知蛋白有相互作用的蛋白對照GST 的結(jié)合較弱！b. 免疫共沉淀免疫沉淀：通過抗原與抗體的結(jié)合得到所要的蛋白質(zhì)免疫共沉淀：通過抗原與抗體的結(jié)合，得到與該已知蛋白有相互作用的蛋白質(zhì)優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。 缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；(2) 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； (3) 必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。c. 蛋白質(zhì)分析技術：SDS－PAGE：蛋白質(zhì)按分子大小分離。Western Blot：顯示特異蛋白質(zhì)的技術?；驹恚翰捎玫氖蔷郾０纺z電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（PVDF膜全面優(yōu)于nitrocellulose膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。決定因素：SDS－PAGE acrylamide的濃度 蛋白質(zhì)上樣的量 相鄰泳道的蛋白質(zhì)量、離子強度和樣品體積 轉(zhuǎn)移膜 轉(zhuǎn)移電流 抗體注意點：電轉(zhuǎn)移效率PVDF膜的充分浸潤轉(zhuǎn)移液中有太多的SDS膜的損壞轉(zhuǎn)移時膠和膜沒有完全接觸抗體的問題抗體的濃度太高或太低還原性物質(zhì)的存在封閉不充分等電聚焦：蛋白質(zhì)按PI值分離。非變性電泳：蛋白質(zhì)按分子量和電荷的比值分離?？捎脕矸蛛x具有生物活性的蛋白質(zhì)。d. Far westernl 不是用抗體直接與膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，而是用另一個蛋白質(zhì)通過相互作用與膜上蛋白質(zhì)作用。l 直接標記另一個蛋白質(zhì)或用抗另一個蛋白質(zhì)的抗體做Western blot。l 因為是蛋白質(zhì)相互作用，F(xiàn)ar－Western常常會包含一步蛋白質(zhì)復性的過程。e. Surface plasmon resonance原理： 表面等離子體諧振（SPR）利用SPR傳感器通過檢測共振角或共振波長的變化來檢測待測分子的成分，濃度及參與化學反應的特性。生物檢測上，主要用于檢測生物分子的結(jié)合作用或者通過生物分子結(jié)合作用的檢測來完成特定生物分子的識別及其濃度的測定。優(yōu)點：lablefree detection Real time measurement特點：SPR技術因其高效靈敏無需額外標記等優(yōu)勢，廣泛應用與蛋白質(zhì)檢測和蛋白蛋白相互作用等蛋白質(zhì)組學研究，它能在保持蛋白質(zhì)天然狀態(tài)的情況下實時提供靶蛋白的細胞器分布，結(jié)合動力學及濃度變化等功能信息，為蛋白質(zhì)組研究開辟了全新模式。f. Twohybrid system(酵母雙雜交)典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子， 如GALGCN等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbinding domain)(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionactivating domain)(AD)。前者可識別DNA上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復合體的其他成分作用， 啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當部位打開， 仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。因此當在DB上連接X蛋白，AD上連接Y蛋白時，若X與Y有相互作用，則同樣可以激活lacZ的表達。因此，通過酵母雙雜交可以發(fā)現(xiàn)新的相互作用的蛋白質(zhì)，如X，Y。lacZ 作為reporter gene，用藍白篩選的方法檢測。TwoHybrid的優(yōu)點：是酵母細胞內(nèi)的in vivo相互作用。只需要cDNA，簡單。弱的相互作用也能檢測到。TwoHybrid的缺點：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用。酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾。自身激活報告基因。都基因庫的要求比較高，單向1/3是in frame蛋白質(zhì)毒性。第三者Z插足介導的相互作用。假陽性。