免疫印跡法的實驗技術(shù)-資料下載頁
2025-08-05 02:42本頁面
【正文】 劑盒 實驗步驟 ? 封閉：將轉(zhuǎn)移后的膜浸入封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動封閉1h（或 4℃ 過夜）；（封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點，使抗體只能跟特異的蛋白結(jié)合） ? ①將一抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度； ②將封閉后的膜放入一抗工作液中， 4℃ 反應(yīng)過夜 (或 37℃ ,2小 時 )。 ? 將膜從一抗中取出， TBST洗滌 10min3，室溫下緩慢搖動洗滌 。 ? ①將二抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度 。 ②將膜放入二抗工作液中室溫 30min。 ? TBST洗滌 10min3，室溫下緩慢搖動洗滌 ? （或 DAB顯色） 曝光及洗片方法 ?①按 1:1（ v/v）混合 ECL試劑盒中兩種液體。 ?②將上述混合液均勻鋪在 NC膜表面，室溫作用 2分鐘。抖掉膜上液體，將其放入鋪有保鮮膜的曝光盒中，再將保鮮膜折疊，以包裹住 NC膜（避免在膜的上面出現(xiàn)氣泡）。 ?③在暗室中（紅光下）將 X光膠片直接壓于包裹后的膜上，曝光盒中曝光適當時間。 ?④將曝光后 X光片放入顯影液中顯影、清水中漂洗、定影液中定影 1分鐘（具體曝光時間及顯影時間需根據(jù)顯影結(jié)果作出調(diào)整） 實驗注意事項 ，切勿使膜干掉 （否則導(dǎo)致背景增高） （濃度高不一定效果好，過高會導(dǎo)致背景變黑） 淬滅 時間來選擇合適的曝光時間。 NC膜時，避免膜上有氣泡，影響顯影。 顯影、定影要充分， X平要完全浸沒在液面下。 Western Blot常見問題分析 ?SDSPAGE電泳 ? 膠不平？ ? 凝膠漏液？ ? 膠板洗刷干凈 ? 加入 APS和 TEMED的量要合適 ? 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 ? 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻 ? 兩塊玻璃板底部要對齊，支架要上緊，膠墊老化失去彈性 ? 條帶比正常的窄？ ? “ 微笑 ” 或 “ 倒微笑 ” 條帶？ ? 斜坡型條帶？ ? 條帶發(fā)散不壓線？ ? 凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩 ? 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 ? 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度 ? 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適， 兩邊聚合不完全。︵ ? 凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。 ︶ ? 電泳液過少，氣泡進入上樣孔，電阻過大 ? PH值不對，電泳液緩沖作用降低 ?轉(zhuǎn)膜及抗體檢測 ? 凝膠腫脹或卷曲？ ? 條帶歪斜或漂移？ ? 單個或多個白點？ ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱 ？ ? 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 510min ? 電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄， “ 三明治 ” 結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙 ? 確保膜和膠塊之間沒有氣泡 ? 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫 ?背景太高 膜沒有均勻浸濕或出現(xiàn)干膜 膜或者緩沖液污染 封閉不充分 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng) 抗體濃度過高 原因 對 策 轉(zhuǎn)膜前用電轉(zhuǎn)液將膜完全浸濕，操作過程避免干膜 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng) 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度 LOGO Add your pany slogan
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