【正文】 光物質(zhì)作為底物 ， 以化學(xué)發(fā)光法 檢測(cè)酶的活性 ， 則為 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 （ chemiluminescent enzyme immuno assay， CLEIA） 。 ? CLEIA方法的檢測(cè)限低至 1017mol/L， 達(dá)到或超過放射免疫分析的靈敏度 。 ? 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析實(shí)際上是一種酶聯(lián)免疫測(cè)定過程 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 CLEIA常用的標(biāo)記酶 ? CLEIA方法中最常用的是辣根過氧化物酶和 葡萄糖氧化酶 （ GOD） 。 ? 此外還有 丙酮酸激酶 、 葡萄糖 6磷酸脫氫酶 、 螢火蟲素酶 、 堿性磷酸酶 （ AP） 和 β D半乳糖苷酶 等 。 ? HRP標(biāo)記 的 CLEIA， 常用 的底物為魯米諾或其衍生物 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 魯米諾 的氧化反應(yīng)在 堿性 緩沖液中進(jìn)行 ， 通常以、 Tris緩沖液 作底物液 ， 魯米諾和H2O2在無(wú) HRP催化時(shí)也能緩慢 自發(fā)發(fā)光 ， 而在最后光強(qiáng)度測(cè)定中造成 空白干擾 ， 因而宜 分別配制 成兩瓶試劑溶液 ， 只在用前即刻混合 。 ? HRP催化魯米諾的氧化 反應(yīng)可被 某些 酚類物質(zhì) （ 如對(duì)碘苯酚 ） 或 螢火蟲熒光素酶 等 增強(qiáng) 。 ? 增強(qiáng)劑的作用是 增強(qiáng)發(fā)光 和 延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間 ， 由此可提高敏感度 。 ? 另外一些 金屬配合物 能催化魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 利用 GOD對(duì) 葡萄糖 的催化氧化 產(chǎn)生 H2O2， 用 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物檢測(cè) 產(chǎn)生的 H2O2， 可間接測(cè)定 GOD的活性 。 ? 常見發(fā)光反應(yīng)底物有 魯米諾 、 TCPO等 。 ? 如 Masako和 Akio以 GOD為標(biāo)記酶 ， 魯米諾 H2O2作為發(fā)光底物 ， 以流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析測(cè)定 17α 羥基孕甾酮 、 甲胎蛋白 和 胰島素 ， 檢測(cè)限分別為 、 而且分析速度快 ， 測(cè)定結(jié)果精密度好 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 CLEIA常用的發(fā)光增強(qiáng)劑 ? 在反應(yīng)體系中引入增強(qiáng)劑 ， 可 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度 ， 提高 化學(xué)發(fā)光測(cè)定的 信噪比 ， 提高 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 靈敏度 。 ? 最常用的增強(qiáng)劑有 螢火蟲熒光素 、 苯并噻唑 、 苯酚取代物 、 取代聯(lián)苯胺 、 酸類衍生物 、 萘酚 等 。 ? 例如 ， 螢火蟲素 、 6羥基苯噻唑衍生物等能加強(qiáng) HRP催化魯米諾等的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) ， 使其強(qiáng)度提高 80倍； ? 某些酸類衍生物尤其是對(duì)碘酸 、 苯甲酸等的增強(qiáng)效果更佳 ， 可使其發(fā)光強(qiáng)度提高 1000倍 ， 且延長(zhǎng)發(fā)光持續(xù)時(shí)間 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 三 、 生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 在 1885～ 1887年 ， Dubois從發(fā)光昆蟲和有雙殼的軟體動(dòng)物體內(nèi)提煉出各種材料 ， 發(fā)現(xiàn)這些材料混合在一起能產(chǎn)生發(fā)光；他將其中可被 穩(wěn)定加熱 的物質(zhì)稱為 熒光素 ， 而將 加熱不穩(wěn)定 的物質(zhì)稱為 熒光素酶 。 ? 生物發(fā)光 現(xiàn)象的化學(xué)本質(zhì)就是 熒光素 與 熒光素酶 發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ， 可看成是特殊形式的化學(xué)發(fā)光 。 ? 一般而言 ， 生物發(fā)光 量子產(chǎn)率 和 特異性 均比化學(xué)發(fā)光高 ， 量子產(chǎn)率接近 100％ ， 發(fā)光強(qiáng)度大 ， 持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)， 發(fā)光穩(wěn)定 ， 故 生物發(fā)光分析靈敏度高 ， 容易測(cè)定 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 將高靈敏度的 生物發(fā)光 與特異性的 酶聯(lián)免疫分析 技術(shù)相結(jié)合便形成生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法 （ BLEIA） 。 ? 常采用 戊二醛法 將 熒光素酶 與 抗原 或 抗體 結(jié)合 。 ? 現(xiàn)在已經(jīng)可以提取純度很高的熒光素和熒光素酶 ， 建立起了各種各樣的生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法 ， 這些方法應(yīng)用于生物體液中各種激素 、 藥物 、 微生物 、 抗原 、 抗體等成分的測(cè)定 。 ? 生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析在臨床分析上也越來(lái)越廣泛地引起人們的重視 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 最常用于生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的生物發(fā)光反應(yīng)有以下兩種： （ 1） 熒光素 熒光素酶生物發(fā)光體系 。 ? 熒光素 （ LH2） 和 熒光素酶 （ E） 在 三磷酸腺苷 （ ATP） 、 Mg2+、 O2存在下 ， 可產(chǎn)生 焦磷酸 （ PPi） 和 一磷酸腺苷 （ AMP） ， 接著 O2和 E， LH2， AMP引導(dǎo)熒光素脫羧， 形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物 —— 氧化熒光素 （ L*） ， 它在返回基態(tài)時(shí)發(fā)光 ， 發(fā)射光的波長(zhǎng) λ max=562nm。 ? 利用上述 生物發(fā)光反應(yīng)與 一個(gè) 酶催化的反應(yīng)相耦合 ，即可進(jìn)行生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 例如用 葡萄糖 6磷酸脫氫酶 標(biāo)記 三硝基甲苯 （ TNT） ，利用葡萄糖 6磷酸脫氫酶能催化 葡萄糖 6磷酸 和 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （ NAD+） 的反應(yīng) 與生物發(fā)光反應(yīng)相耦合 。 ? 葡萄糖 6磷酸脫氫酶的活性較好 ， 1018mol/L的葡萄糖 6磷酸脫氫酶每分鐘能產(chǎn)生 1014mol/L的NADH， 這樣可以大大提高靈敏度 ， 對(duì) TNT的檢測(cè)限達(dá) 1018mol/L。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 （ 2） 熒光素酶 黃素單核苷酸 （ FMN） 細(xì)菌生物發(fā)光體系 。 ? 此體系中有 熒光素酶 和 FMN氧化還原酶 兩種酶參與 。 ? FMN氧化還原酶 在還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（ 輔酶 Ⅱ NADPH） 和 H+存在下 ， 能使 FMN還原 成還原型的黃素單核苷酸 （ FMNH2） 。 ? 接著 熒光素酶 在有 O2的情況下 ， 催化 還原型黃素單核苷酸 和 長(zhǎng)鏈脂肪醛 氧化產(chǎn)生 FMN和 長(zhǎng)鏈脂肪酸 并產(chǎn)生發(fā)光 ， 發(fā)射波長(zhǎng)為 λ max=490nm， 從而可以進(jìn)行生物發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè) 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 四 、 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的應(yīng)用 ? 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 是現(xiàn)代痕量分析中一項(xiàng)重要技術(shù) ，其應(yīng)用非常廣泛 ， 已有大量綜述文獻(xiàn) ， 這里不做詳細(xì)介紹 ， 僅以標(biāo)記 HRP、 GOD的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析和生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析為例做簡(jiǎn)單說(shuō)明 。 （ 1） 以 HRP為標(biāo)記酶 標(biāo)記抗原或抗體 ， 以 魯米諾 H2O2為底物 測(cè)定了單純皰疹病毒 、 人絨毛膜促性腺激素 、 白色念珠菌等物質(zhì)； ? 以 異魯米諾 H2O2為底物 測(cè)定了巨細(xì)胞病毒抗原 、 甲胎蛋白 、 抗魯白寧 IgG、 皮質(zhì)醇等； ? 以 鄰苯三酚 H2O2為底物 測(cè)定登革熱 Ⅱ 型病毒 b、 傷寒桿菌 、 細(xì)菌內(nèi)毒素等物質(zhì) 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 （ 2） 以 GOD為標(biāo)記酶標(biāo)記 抗原或抗體 ， 以 魯米諾 H2O2為底物 測(cè)定了 17α 羥基孕甾酮 、 甲胎蛋白 、 胰島素 、甲狀腺素等； ? 以 雙 （ 2,4,6三氯苯基 ） 草酸酯 （ TCPO） H2O2為底物 測(cè)定了脫氫表雄甾酮 、 甲胎蛋白 、 促甲狀腺素 、 催乳素 、 17α 羥基孕甾酮等物質(zhì) 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 （ 3） 以 熒光素酶為標(biāo)記酶 ， 以 熒光素酶 熒光素發(fā)光體系 的生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析測(cè)定了轉(zhuǎn)鐵蛋白 、 胰島素、 艮他霉素 、 氨甲蝶呤 、 馬來(lái)酰亞胺苯甲?；?N琥珀酰亞胺 、 孕酮 、 人絨毛膜促性腺激素 、 甲胎蛋白 、促黃體生成激素等； ? 以 熒光素酶 FMN生物發(fā)光體系 的生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析測(cè)定了二硝基苯酚 、 三硝基甲苯 、 甲胎蛋白等各種物質(zhì) 。 ? 它們的檢測(cè)限可達(dá)到 pmol/L甚至 fmol/L級(jí) 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 什么是免疫分析？ 免疫分析方法可分為哪些種類？ 酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶應(yīng)符合哪些條件？如何對(duì)所用酶的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)？酶聯(lián)免疫分析中常用的酶有哪些？ 簡(jiǎn)述 ELISA的原理及特點(diǎn)。 ELISA固相載體的一般采用什么材料，有哪些形式？ 什么是包被？什么是封閉？ ELISA中常使用哪些稀釋液、洗滌液和酶反應(yīng)終止液？ 辣根過氧化物酶的 RZ值是指什么？對(duì)其有什么要求？HRP的常用底物有哪些？ AP的常用底物有哪些？ β D半乳糖苷酶的常用底物有哪些？青霉素酶的常用底物有哪些？ 思考題 ELISA的酶聯(lián)有哪些方法？ ELISA試驗(yàn)方法有哪些，如何進(jìn)行？ 1 ELISA反應(yīng)中，如何選擇適宜的包被濃度？如何選擇適宜的酶結(jié)合物濃度？如何選擇適宜的酶 底物反應(yīng)時(shí)間？ 1 ELISA放大系統(tǒng)有哪些？ 1如何計(jì)算酶標(biāo)記免疫復(fù)合物中的酶量、酶結(jié)合率和摩爾比值？ 1化學(xué)發(fā)光是如何產(chǎn)生的？化學(xué)發(fā)光劑有哪些種類？ 1化學(xué)發(fā)光免疫分析可分為哪些種類？ 1化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的標(biāo)記酶有哪些？化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的發(fā)光增強(qiáng)劑有哪些？ 1最常用于生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的生物發(fā)光反應(yīng)有哪些？ 思考題