免疫熒光技術(shù)-資料下載頁
2024-08-14 02:48本頁面
【正文】 內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。 （ 3） Triton X100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。 封閉血清的選擇原則是什么？ （ 1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假 陽性！ （ 2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和 組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié) 合，會造成背景。 （ 3）也可以用小牛血清、 BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。 抗體孵育條件的比較？ （ 1）一抗孵育溫度有幾種： 4度、室溫、 37度，其中 4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37度 12h，而 4度過夜和從冰箱拿出后 37度復(fù)溫 45min。 （ 2）二抗一般室溫或 37度 30min1h，具體時間需要摸索。 一抗 4度孵育后為什么要進行 37度復(fù)溫？ （ 1）一方面，防止切片從 4度直接放入 PBS易脫片； （ 2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達(dá)較弱的抗原可能有，4 度和 37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。 如何最大限度地降低組織非特異性染色？ （ 1）縮短一抗 /二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。 （ 2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 （ 3）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果； （ 4）適當(dāng)增加 PBS沖洗次數(shù)和浸洗時間，在一抗、二抗孵育之后的浸洗尤為重要； （ 5）防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。 背景染色較深的原因有哪些？ （ 1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體 前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃 度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進行染色。 （ 2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶 報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整。 （ 3）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、 滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用 DAKO筆或 PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。 （ 4）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于 24小時）：原因尚不清楚，但現(xiàn)象 存在。如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太長。 （ 5）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要么不顯色要 么背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。 做間接法免疫熒光染色，如何設(shè)置對照？ 最好是同一視野在未用熒光激發(fā)下進行對照，看是否非特異性染色。 （ 1）空白對照：如果你做的是石蠟切片免疫熒光，這個對照必須有，目的是看自發(fā)熒光，脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。 （ 2）陰性對照：標(biāo)本直接滴加二抗，呈陰性反應(yīng)。 （ 3）抗原對照：標(biāo)本加同種動物的未免疫血清，以 PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng)。 免疫熒光雙染抗體的選擇注意哪些？ THANK YOU ！
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