免疫熒光技術(shù)(更新版)
【正文】 命，也會影響鏡檢的效果。 復(fù)染： 目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位； 一般常用 DAPI復(fù)染。 使組織內(nèi)各種物質(zhì)產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定。在 488nm波長激發(fā)下， PI的發(fā)射光譜為 610620nm。 藻紅蛋白 （ Pphycoerythrin， PE） PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素，分子量為 240kD的蛋白，最大吸收峰為 564 nm，當(dāng)使用 488 nm激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為 576 nm，對于單激光器的流式細(xì)胞儀來說，推薦使用 585177。 四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。 多激光器系統(tǒng)（多通道激光檢測）： 在可見光范圍內(nèi)使用 多譜線氬離子激光器，發(fā)射波長為 457nm、 488nm和 514nm的藍(lán)綠光， 氦氖綠 HeNe（ G）激光器提供發(fā)射波長為 543nm的綠光， 氦氖紅 HeNe（ R）激光器發(fā)射波長為 633nm的紅光， 新的 405nm的半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線。 樣品不能太厚。 激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細(xì)胞形態(tài)的測量 , 配合焦點穩(wěn)定系統(tǒng)可以實現(xiàn)長時間活細(xì)胞動態(tài)觀察。 根據(jù)實驗方法分類： ? 直接法 ? 間接法 ? 補(bǔ)體法 ? 其他 補(bǔ)體法： 利用補(bǔ)體反應(yīng)，通過形成 抗原 抗體 補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光。 偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān)。 熒光漂白及對細(xì)胞組織的照射損傷。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)或熒光素。 FITC分子量為 ，最大吸收光波長為 490～ 495nm，最大發(fā)射光波長為 520～ 530nm，呈現(xiàn)明亮的 黃綠色熒光 。 酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì) 某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。 FL2探測器檢測 PE。 1. 細(xì)胞的固定 【固定的定義】 將新鮮的活體組織或細(xì)胞，立即加入固定液中，以此使細(xì)胞保持原有形態(tài)、結(jié)構(gòu)的一種方法。 選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。 切片清洗： 為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時間 和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗的清洗是 5min*3次； 注意（ 1）單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。缺點是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對 小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高， 但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。如 santa Cruz公司抗體一般 1ml，價格 2100元左右；而 chemicon 公司一抗一般 100ul，價格 2800元左右。 抗體孵育條件的比較？ （ 1）一抗孵育溫度有幾種： 4度、室溫、 37度，其中 4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37度 12h，而 4度過夜和從冰箱拿出后 37度復(fù)溫 45min。 背景染色較深的原因有哪些？ （ 1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。 （ 5）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要么不顯色要 么
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