dna重組技術(shù)-資料下載頁
2025-08-04 13:27本頁面
【正文】 NTP加到引物的 3’OH末端，使引物延長 ， 合成出新的互補(bǔ)的 DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷 (ddNTP） ,由于雙脫氧核糖的 3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的 dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同 5’引物端和以 ddNMP殘基為 3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個(gè)核苷酸的單鏈 DNA， 從而讀取 DNA的核苷酸序列。雙脫氧終止法測序反應(yīng)體系包括 ：DNA聚合酶單鏈 DNA模板帶有 3OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種 dNTP(aATP,dGTP,dCTP和 dTTP)4種 ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和 ddTTP)Sanger法 DNA測序的試劑① 引物：通常由 2023個(gè)堿基構(gòu)成， G+C=12， A+T=8到 11， Tm=6068℃ ， 避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)② 模板③ DNA聚合酶④ 2′， 3 ′雙脫氧核苷三磷酸（ 2′, 3 ′dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ）⑤ dNTPB克隆 DNA序列檢測DNA序列分析法雙脫氧末端終止測序法的基本操作： A C G T ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA Primer Primer Primer Primer Klenow Klenow Klenow KlenowdNTPs dNTPs dNTPs dNTPsddATP ddCTP ddGTP ddTTPA G T C DNA聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能測定法 淀粉酶目的基因的鑒定： 淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。將待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的 目的重組子 可其表達(dá)的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴(kuò)散，同時(shí)降解淀粉為可溶性的多糖或單糖。因此， 目的重組子 菌落周圍會(huì)形成透明圈。如果透明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底，易于辨認(rèn)。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進(jìn)行鑒定C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能測定法 抗菌素抗性基因的鑒定： 抗菌素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對該抗生素的抗性。據(jù)此，只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素，理論上長出的菌落即是含有目的基因的目的重組子 在實(shí)際操作過程中，由于抗生素有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性，因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒，二次轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。如果此時(shí)轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落，即可認(rèn)為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能測定法 抗菌素抗性基因的鑒定： 目的重組子 誘導(dǎo)抗性 抽取重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能測定法 DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定： 影印用 聚乙烯薄膜 影印裂解平板 洗滌雜交感光輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定 80℃ 烘干固定影印薄膜 與探針溶液中雜交 洗滌、干燥、感光 用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌體噴灑 克隆平板 聚乙烯膜探針選用能與 目標(biāo)蛋白特異 性結(jié)合的 DNA 片段 該方法用于 cDNA文庫中目的基因的篩選。其原理是在體外無細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯中利用 cDNA與 mRNA雜交后導(dǎo)致 mRNA的不能翻譯，從而篩選陽性克隆子。 分離的基因編碼著豐富的 mRNA。 優(yōu)點(diǎn) ：不需要克隆基因的表達(dá)，不需要探針或抗體。 缺點(diǎn)： 較煩瑣。 C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能測定法步驟： 1. 將從大腸桿菌菌落或噬菌體 群體 中制備的帶有目的基因 的重組質(zhì)粒 DNA變性后，與總 mRNA雜交； 2. 轉(zhuǎn)入無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯體系（麥胚提取物或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物） ,由于加有 35S標(biāo)記的蛋氨酸，轉(zhuǎn)譯的多肽蛋白質(zhì)可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影進(jìn)行分析； 3. 結(jié)果同未雜交的 mRNA轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物作比較，從中找出其轉(zhuǎn)譯合成被抑制的 mRNA， 即同目的基因變性 DNA互補(bǔ)彼此雜交的 mRNA。C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能測定法C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法 放射免疫原位雜交 鑒定： 影印用固定了特異性抗體的 聚乙烯薄膜 影印洗滌與 I125標(biāo)記的 IgG保溫感光輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定 與 I125標(biāo)記的 IgG保溫洗滌、干燥、感光 用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌體噴灑 克隆平板 含抗體的聚乙烯膜 裂解平板 C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法 免疫沉淀 鑒定： 在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體 然后涂布轉(zhuǎn)化液 37℃ 培養(yǎng) 經(jīng)培養(yǎng)后，目的重組子菌落變會(huì)分泌出目標(biāo) 蛋白，后者與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀 反應(yīng)，在菌落周圍形成白色的圓斑 此法簡便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大 C外源基因產(chǎn)物檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳法 如果待篩選鑒定的目標(biāo)蛋白既不能測定生物活性，又無現(xiàn)成的抗體使用，則可采用 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行粗略的篩選
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