【正文】 ardiovasc Pharmacol (review, in press)5. 其他新發(fā)現(xiàn)的心血管活性物質(zhì)在心腦血管疾病中的病理生理學意義研究 心腦血管疾病是復雜疾病，許多種活性物質(zhì)都參與其發(fā)病過程，近年來‘反向生物學’的孤兒受體策略新發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)有可能成為心腦血管疾病研究和防治的重要靶點。我們對下述新發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)在心腦血管疾病中的病理生理學意義研究起步較快，在國際首先報導或引起了較大重視：目前已知最強的內(nèi)源性縮血管物質(zhì)Urotensin II (Peptides. 2004 。25(11):19771984. Heart Vessels. 2004 。19:818. Chin Med J (Engl). 2004 。117:3741. Chin Med Sci J. 2001 。16:2315. Peptides. 2002 。23:16315. Heart Vessels. 2002 。16:648. )。 內(nèi)源抗纖維化肽Relaxin (Peptides. 2005 。26:16329.)。 心臟刺激肽Salusin (Regul Pept. 2004。122:1917。)。 磷脂介質(zhì)Lysophospatidic acid (Regul Pept. 2004。121:4956. Chinese Medical Sciences Jornal 18:213217, 2003)。 花生四烯酸表氧化酶產(chǎn)物Epoxyeicosatrienoic acid(Cancer Res 65:470715, 2005。 Mol Cancer Res. 2005。3:317323. J Pharmacol Exp Ther 314:522532, 2005) 等。進一步的工作需研究它們在心腦血管疾病發(fā)病中的整合生理學意義。6. 血管鈣化發(fā)病的心血管活性物質(zhì)調(diào)控機制的研究血管鈣化是動脈硬化、高血壓和唐尿病血管病的長見的共同病理表現(xiàn)。既往認為是無機鈣磷鹽的被動沉積于血管細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)，近年新發(fā)現(xiàn)血管鈣化是類似骨發(fā)育的主動過程。其發(fā)病機制尚未完全闡明，似與氧自由基、細胞凋亡及鈣調(diào)節(jié)激素紊亂等多因素有關(guān)。我們同過系列的體內(nèi)外實驗的研究，提出血管鈣化的血管活性物質(zhì)調(diào)控機制的假說，即:并不直接作用于鈣磷代謝的血管組織局部的旁分泌/自分泌功能紊亂，最終導致血管壁細胞向成骨細胞表型轉(zhuǎn)化以形成血管鈣化。血管內(nèi)源性內(nèi)皮素、血管緊張素II和Urotensin II為促進血管鈣化的、而腎上腺髓質(zhì)素、Ghrelin、NO、CO、H2S為抑制血管鈣化的活性物質(zhì)，其間的平衡定血管壁細胞的表型。我們還發(fā)現(xiàn)血管壁細胞Adrenomedullin（ADM）/ADM receptor系統(tǒng)是抗血管鈣化形成的重要防御體系，其機制可能與cAMP/PKA途徑和MAPKs途徑被激活有關(guān)。體內(nèi)和體外實驗都證實外源應用ADM具有顯著防治血管鈣化的作用。文章在下述國際雜志發(fā)表后，受到多次引用。Z Kardiol 2002。 91:568574. . Life Sciences2003。 72:10271037. Peptides 2003。 24:28794； J Cardiovasc Pharmacol. 2003。 42:8997. Life Sci. 2003。 74:451461. Peptides. 2003。 24:114956.Z Kardiol 2003。 92:17. Z Kardiol. 2004。 93:10915.Peptides 2004。25:601608。 Heart Vessels. 2004。 19(3):12531.J Geriatric Cardiology 2004。 12:108113. Life Sciences 2005。 77: 966979. Regulatory Peptides 2005。129:125132. Regulatory Peptides 2005。 129:167176.（四）、內(nèi)源性心血管細胞保護物質(zhì)的分子機制研究機體內(nèi)存在有強大的自身抗病、防病機制，存在著各種內(nèi)源性抗病物質(zhì)和致病因子的抑制因子，內(nèi)源性抗病機制能促進抗病物質(zhì)的合成和分泌，抑制致病因子的合成和分泌。闡明防治心腦血管疾病的自身抗病機制，調(diào)節(jié)、恢復和補充體內(nèi)的內(nèi)源性抗病物質(zhì)，修復心血管細胞的損傷和功能，是防治心血管疾病的一個重要的新方向，亦是發(fā)展心血管新藥物和防治新途徑的重要源泉。1．尋找參與缺氧預處理引起的細胞保護作用的內(nèi)源性物質(zhì)①通過新建立的蛋白質(zhì)組學技術(shù)，在肺II型上皮細胞找到經(jīng)缺氧預適應明顯表達上調(diào)的蛋白之一鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin, CRT)，鈣網(wǎng)蛋白介導了該細胞的缺氧/預適應對細胞缺氧再復氧（再灌注）損傷, 其機制是通過增加抗氧化的硫氧還蛋白（thioredoxine）抑制氧自由基的產(chǎn)生，最終抑制JNK MAPKAP1而實現(xiàn)的。②采用蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定出心肌缺血預適應延遲相的13個差異蛋白，其中谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶Yb蛋白酪氨酸磷酸酶εC、長鏈脂肪酸輔酶A連接酶、維生素D結(jié)合蛋白和重組活化蛋白2等8個蛋白質(zhì)屬首次發(fā)現(xiàn)與心肌缺血預適應有關(guān)。這些差異蛋白可能通過其分子伴侶功能、清除自由基、改善心肌能量代謝等參與了心肌缺血預適應延遲相的心肌保護作用。③從多個水平探討了氧化應激損傷時心肌細胞凋亡的發(fā)生機制。證實了HSP70可通過抑制線粒體通路和死亡受體通路的活化及其crosstalk通路，從而減輕H2O2所致的原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞和C2C12肌原細胞的凋亡。采用免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多個與HSP70 及αB晶狀體蛋白相互作用的凋亡相關(guān)蛋白。(Free Rad Biol Med, 2005, 39:658667)④采用過表達熱休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)基因的細胞株及HSF1 基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)HSF1可促進另一核轉(zhuǎn)錄因子KLF4 的表達，而KLF4可促進αB晶狀體蛋白，HSP25，HSP84和 HSP86等熱休克蛋白的表達。上述發(fā)現(xiàn)揭示了HSP基因表達調(diào)控的新機制。2．炎癥/缺氧誘導具有細胞保護作用的CGRP從神經(jīng)和免疫細胞分泌及其意義的研究①除了我們發(fā)現(xiàn)致炎因子IL－1b和趨化因子可以刺激感覺神經(jīng)元神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽CGRP表達和釋放增多（J Neurosci Res，2003, 73:188197。 J Neurosci Res 2005。 2005, 82:5162）以外，我們新發(fā)現(xiàn)了激活人和大鼠T淋巴細胞一定時間后還可誘導免疫細胞神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽CGRP表達和分泌增多，后者以自分泌和旁分泌形式抑制T淋巴細胞的增殖和IL2的分泌（J Neuroimmunol, 2002, 130: 155162），致炎因子IL－1b還可以誘導非特異免疫細胞：II型肺上皮細胞分泌神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽CGRP增多，其機制是通過PKCgp38 MAPK核轉(zhuǎn)錄因子NFkB從而引起bCGRP分泌增加（FASEB J, 2004。18:16031605）。分泌的CGRP通過作用于CGRP 1受體抑制II型肺上皮細胞IL－1b引起的趨化因子MCP1 和IL8的分泌及其分子機制（Submitted, 2005）；CGRP還可通過作用于T細胞的CGRP 1受體抑制Th1和增加Th2功能，從而減輕1型糖尿病大鼠胰島b細胞炎癥損傷(Eur J Immunol, 2003, 33:233242)。由此提出這可能是免疫系統(tǒng)保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機制之一，CGRP作為介導神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)制分子發(fā)揮著重要作用。②從離體肺II型上皮細胞水平證明，外源CGRP或CGRP轉(zhuǎn)基因法以及外源性CGRP拮抗劑或肺II型上皮細胞CGRP缺失（RNAi）法均證明，CGRP參與缺氧預適應的機制之一是通過PKCe的增加，進而增加HSP70的表達，介導了肺II型上皮細胞缺氧/預適應對細胞缺氧再灌注損傷(J Biol Chem, 2005, 280:2032520330)。此外，經(jīng)過外源CGRP或CGRP轉(zhuǎn)基因法以及外源性CGRP拮抗劑或CGRP缺失（RNAi）法以及整體動物CGRP基因治療法證明CGRP通過增加平滑肌細胞凋亡而抑制血管損傷后的再狹窄發(fā)生（Am J. Physiol Heart Circ Physiol, 2004, 287: H1582H1589）。3．生長素（Ghrelin）的心血管保護作用Ghrelin是含28個氨基酸殘基的多肽，是2000年新發(fā)現(xiàn)的、生長激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體，調(diào)節(jié)機體代謝稱為“終極代謝激素” 。近來發(fā)現(xiàn)心血管組織能生成ghrelin而且富含ghrelin受體。我們較系統(tǒng)研究了ghrelin的心血管病理生理意義，觀察到ghrelin可以部分糾正敗血癥休克大鼠的血流動力學紊亂和代謝障礙；ghrelin具有增強心功能、減輕缺血再灌注引起的心肌損傷及改善心肌氧耗的作用；具有治療異丙基腎上腺素引起的心肌損傷和拮抗血管鈣化等治療效應。體外實驗。ghrelin抑制人內(nèi)皮細胞與單核細胞的結(jié)合、抑制NFkB的激活和體內(nèi)內(nèi)毒素引起的促炎因子的產(chǎn)生。Ghrelin的抗炎作用提示它在動脈粥樣硬化尤其是伴發(fā)肥胖病人（肥胖病人的ghrelin是降低的）發(fā)病中可能起重要的調(diào)節(jié)作用。我們提出了Ghrelin是內(nèi)源性心血管細胞保護物質(zhì)的觀點，受到國際學術(shù)界關(guān)注，發(fā)表的文章已被引用40余次。上述研究結(jié)果發(fā)表在 Circulation,2004,109: 22212226Acta Pharmacol Sin,2003, 24:4549. Eur J Pharmacol, 2003,473: 171176Acta Pharmacol Sin. 2004,25:11311137 Regulatory Peptides，2004,122：173178；Regulatory Peptides,2005,129:167176 （五）心血管活性物質(zhì)和信號轉(zhuǎn)導通路的復雜體系研究1．代謝同源性分子‘家系’網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的研究模式小分子活性物質(zhì)種類繁多，其生物學效應間的相互作用形成復雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。目前對于分子間的相互作用的研究，主要按‘功能同源’（舒縮血管、細胞生長分化等功能）或‘結(jié)構(gòu)同源’的分子群研究。這種研究模式對小分子活性物質(zhì)并不很合適，因其結(jié)構(gòu)簡單（‘結(jié)構(gòu)同源’少）而且功能廣泛（‘功能同源’難歸類）。我們通過對腎上腺髓質(zhì)素（Adrenomedullin）的系統(tǒng)研究，注意到活性多肽的“分子內(nèi)調(diào)控”現(xiàn)象，即大分子的多肽原前體（prepropeptides）在體內(nèi)形成的眾多活性小分子肽段和酶解小分子中產(chǎn)物；活性多肽在體內(nèi)的功能及對疾病的最終影響取決于這些分子相互作用的綜合效應。我們對作為生物活性分子的蛋氨酸的代謝研究，蛋氨酸代謝產(chǎn)物包括S腺苷蛋氨酸、半胱氨酸、S腺苷同型半胱氨酸、同型半胱氨酸、胱氨酸、牛磺酸、H2S等，各自具有很強的生物學活性，但在體內(nèi)的功能及對疾病的最終影響取決于這些分子相互作用的綜合效應。我們提出小分子活性物質(zhì)的 “代謝同源家系”研究的新模式，研究這些同代謝來源的分子群的相互作用網(wǎng)絡(luò)，作為研究機體復雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系的一部分（初級部分）。在一定程度上以整合的觀點闡明疾病的發(fā)生機制，而且可能從同一‘家系’分子間的相互作用關(guān)系提示復雜疾病防治的新策略。腎上腺素受體在心血管重塑調(diào)控中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)模式研究 現(xiàn)代醫(yī)學在還原論指導下對生命和疾病的認識還是局部的、分離的和不完善的；我們還缺乏對生命系統(tǒng)和生物學行為綜合的、整體的和本質(zhì)的認識和理解，這就需要引入新的思維模式來研究生命現(xiàn)象。心腦血管疾病是多因素參與發(fā)病的復雜疾病。我們探索用復雜系統(tǒng)的研究理念和方法研究腎上腺素受體對心臟血管重塑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們先從激動腎上腺素受體引起心血管重塑時的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)入手，初步確定了在現(xiàn)有基因芯片上的心臟和血管平滑肌表達的基因，找到一些與重塑過程相關(guān)的基因（組）群，發(fā)現(xiàn)了不同腎上腺素受體（及亞型）激動引起不同的基因表達譜變化，揭示了生理性心臟生長和病理性心臟肥厚過程中基因表達譜的差別。在正常生長發(fā)育中的生理性心肌重塑，基因表達群譜的改變利于維持生長發(fā)育所需要的平衡狀態(tài)。病理性心肌重塑所涉及的基因表達群譜改變與生理性重塑雖有相似之處，但病理因素的存在引起了特征性變化，為細胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)基因群和能量代謝基因群的不平衡變化，這種變化有可能是最終導致心衰的病理基礎(chǔ)。在各種不同因素引起的心血管重塑過程中存在有一些共同變化基因，對這些基因的認識有助于揭示重塑過程的共同調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)和關(guān)鍵信號分子。這種研究路徑和手段不同于傳統(tǒng)方法，它需要龐大的原始數(shù)據(jù)系統(tǒng)、優(yōu)秀的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)和新的分析思想。我們與北大數(shù)學系教授合作，利用已獲得的數(shù)據(jù)，反復模擬和修正，初步建立了適合本課題需要的數(shù)據(jù)聚類和網(wǎng)絡(luò)分析的一些計算方法和軟件，確定了一些基因類群以及一些基因與基因之間的依存和調(diào)控關(guān)系，嘗試了對數(shù)據(jù)的挖掘，構(gòu)建局部的基因表達網(wǎng)絡(luò)和建立了初級數(shù)學模式。通過對基因群的啟動子預測分析，發(fā)現(xiàn)聚為同一類的基因可能有共同的啟動子，為揭示基因調(diào)控規(guī)律提供了依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，我們進一部和中科院生物物理所合作，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子及受其調(diào)控的基因之間的關(guān)系，作為支持向量機方法的學習集，通過bayes估計和啟動子分析，結(jié)合傳統(tǒng)分子生物學試驗構(gòu)建信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們對腎上腺素受體引起心肌重塑的比較蛋白質(zhì)組學進行了研究。與基因表達變化相似，腎上腺素受體激動引起心肌細胞蛋白質(zhì)表達變化主要是細胞結(jié)構(gòu)蛋白、骨架蛋白、轉(zhuǎn)運相關(guān)膜蛋白、信號轉(zhuǎn)導相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等，深入的數(shù)據(jù)分析和信息挖掘正在進行中。這部分工作將在蛋白質(zhì)水平揭示信號分子的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，為本項目的深入和持續(xù)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。此外，我們建立了大鼠心肌細胞二維凝膠電泳參考圖譜和數(shù)據(jù)庫，并公布于我們的網(wǎng)上，以便資源共享。這些工作部分發(fā)表于：Cell Mol Life Sci,2003,60:22002209；Clin Exp Pharmac