【正文】 A的靈敏度。而在冰凍和石蠟切片中原位雜交的靈敏度遠(yuǎn)不如培養(yǎng)細(xì)胞，靶DNA僅為40kb，而mRNA為1020拷貝。如何提高組織切片中雜交信號(hào)的敏感度已成為當(dāng)今原位雜交技術(shù)研究的熱點(diǎn)，采用寡核苷酸與多種cRNA探針?biāo)齐u尾酒混合方式，以同一序列合成不同探針來(lái)提高雜交的靈敏度。其次為組織前處理的改進(jìn)、RNA原位雜交和免疫組化并檢技術(shù)和激光共聚焦顯微在多重RNA原位雜交中應(yīng)用等。(一) 組織前處理的改進(jìn) RNA原位雜交中組織固定多推薦 4％ 多聚甲醛，固定時(shí)間不超過(guò)24小時(shí)，尤以冰凍切片為佳。1998年Liu[8]比較了同一腎組織和肺組織，用4% 多聚甲醛和10% 中性福爾馬林固定，石蠟切片和冰凍切片中RNA原位雜交檢測(cè)結(jié)果。、16和48小時(shí)時(shí)間段檢出雜交信號(hào)，經(jīng)圖象分析系統(tǒng)處理并比較陽(yáng)性率、陽(yáng)性強(qiáng)度和雜交信號(hào)定位等表明：(1)固定348小時(shí)時(shí)間段，石蠟切片組結(jié)果好于冰凍切片組；(2)中性福爾馬林固定與多聚甲醛無(wú)明顯差異。同樣的結(jié)果還見(jiàn)于Le[9] 。(二) 雜交信號(hào)放大 通過(guò)原位PCR方法來(lái)擴(kuò)增靶RNA核苷酸片段來(lái)提高原位雜交的敏感性，從理論上講也是成立的。但從近幾年應(yīng)用結(jié)果表明主要存在以下問(wèn)題：(1)如何避
免擴(kuò)增后核苷酸向細(xì)胞外彌散，引起雜交信號(hào)的定位錯(cuò)誤。(2)擴(kuò)增后核苷核又如何得到有
效標(biāo)記，尤其是低敏感度擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記。(3)如何預(yù)防凋亡細(xì)胞和RNA酶處理后切片中核碎
片即非目的核苷酸片段擴(kuò)增。(4)如何保持細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的完整性。(5)如何克服在應(yīng)
用微波和熱處理中使9號(hào)染色體著絲點(diǎn)破壞所造成的假陽(yáng)性?？傊ㄟ^(guò)原位PCR、微波和熱處理方法來(lái)提高靶細(xì)胞核酸數(shù)量或增加敏感性在應(yīng)用中尚存在著異議[1112]。 TSA是酪胺酰胺信號(hào)放大(Tyramide Signal Amplification)的縮寫(xiě)，而CARD則是催化報(bào)道基因*沉淀(Catalyzed reporter deposition CARD)的縮寫(xiě)(*報(bào)道基因：處于另一基因下游并
可反映轉(zhuǎn)錄上游基因表達(dá)水平的基因)。前者名稱側(cè)重酪胺酰胺的放大作用命名[1011]。19
89年Bvbrow首先將TSA應(yīng)用到斑點(diǎn)雜交和ELISA中來(lái)提高檢出信號(hào)的敏感度。1995年由Kerstens[15] 和1997年Speel[13,18]等又將TSA引用到原位雜交中，因?yàn)闄z測(cè)低拷貝的RNA往往得不到有效的雜交信號(hào)，而TSA則使原位雜交的靈敏度提高了2100倍，能在組織切片中檢出多拷貝和單拷貝15kb的DNA 序列為低豐度的mRNA 和rRNA檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。從而在近兩年內(nèi)使RNA原位雜交技術(shù)得到穩(wěn)步發(fā)展并展示廣闊的應(yīng)用前景。 1997年Schmidt[16]首先提出了CARD的命名,1999年 Yang[11]和Speel[13]綜述了CARD在原位雜交中的應(yīng)用。對(duì)酪胺酰胺的放大的原理和應(yīng)用作了詳盡描述：(1)低濃度的酪胺酰胺在辣根過(guò)氧化物酶活性和H2O2的作用下，通過(guò)催化報(bào)道基因使酪胺酶分布在原位雜交點(diǎn)或雜交點(diǎn)附近，使大量半抗原分子(生物素、地高辛、二硝基苯(dinitrophenyl)和熒光素介入而達(dá)到雜交信號(hào)放大。(2)而高濃度的酪胺酰胺在辣根過(guò)氧化物酶活性和H2O2的作用下催化報(bào)道基因直接發(fā)生沉積，使顯色的面積增大而達(dá)到信號(hào)放大。(3)半抗原標(biāo)記的探針與靶核苷酸雜交?與抗半抗原抗體結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)反應(yīng)?又與熒光素標(biāo)記的酪胺酶結(jié)合?在熒光顯微鏡直接顯示。(4)生物素標(biāo)記或半抗原標(biāo)記的酪胺酰胺通過(guò)鏈菌抗生物素、卵白素等?通過(guò)間接放大顯示[15]。TSA或CARD是一種容易、快速、高度敏感和有效的提高雜交信號(hào)放大系統(tǒng)[1018]。尤其是不需要改變?cè)须s交實(shí)驗(yàn)流程，在雜交后加入或與熒光素、鏈菌素抗生物素相連接，以DAB等為底物，避免了 NBT/BCIP 在二甲苯中透明引起信號(hào)褪色，因此為技術(shù)人員所接受，而高敏感度和良好的定位更為病理學(xué)家所接受，而且為常規(guī)福爾馬林固定的標(biāo)本中開(kāi)展以診斷為目的的雜交檢測(cè)創(chuàng)造了條件，也為雜交信號(hào)計(jì)算機(jī)圖象自動(dòng)化處理應(yīng)用開(kāi)拓了應(yīng)用前景。但應(yīng)用TSA或CARD時(shí)應(yīng)遵循以下幾點(diǎn)：(1)按探針?lè)N類和不同組織類型在參考有關(guān)文獻(xiàn)后作出。，參考TSA試劑盒稀釋濃度，在37℃ 或常溫下孵育 515min，預(yù)處理中需抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物；；、地高辛、熒光素、鏈菌素抗生物素、卵白素作間接顯示其放大效果高于直接顯示。(2)最佳信/噪比(Signotonoise ratio)和獲得最大放大效果，在標(biāo)準(zhǔn)化原位雜交流程下進(jìn)行，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整探針濃度和免疫組化流程。(3)為獲得最大限度信號(hào)放大，多采用間接顯示法。通過(guò)鏈菌素抗生物素、酶和卵白素等增加雜交信號(hào)檢出。(4)可采用葡聚糖或高分子量聚乙烯醇[24](
Polyvinyl alcohol)增加酪胺酰胺定位和加速顯色反應(yīng)。(5)雜交后固定應(yīng)省略，越來(lái)越多
研究表明，雜交后固定可導(dǎo)致雜交信號(hào)減弱。總之TSA或 CARD不但能促使原位雜交技術(shù)的發(fā)展，尤其是在RNA原位雜交中顯示無(wú)與論比的應(yīng)用前景。(三) RNA原位雜交與免疫組化雙重檢測(cè)技術(shù) Fransje[19]報(bào)道了在正常表皮,剝落上皮和牛皮癬上皮的組織切片中先后作RNA原位雜
交檢測(cè)其組蛋白表達(dá)，同時(shí)用MIB作免疫組化標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞增值率，以闡述各組表皮的組蛋
白表達(dá)與細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的關(guān)系。這種檢測(cè)的設(shè)計(jì)非常完美，但檢測(cè)技術(shù)較為繁雜。因?yàn)橐话憧?br />血清中含有較多的RNA酶，若先進(jìn)行免疫組化,需加入核酸酶抑制劑，先進(jìn)行原位雜交，雜交
液中不宜含聚蔗糖，否則會(huì)增強(qiáng)免疫組化的染色背景。雜交前的預(yù)處理和雜交后的洗脫不宜
過(guò)度，以免抗原變性或丟失。RNA原位雜交與免疫組化并檢，一般先作原位雜交檢測(cè)，后作
免疫組化檢測(cè)[1922]。(四) 多重RNA原位雜交技術(shù)Grino[23]運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡,成功地將標(biāo)以同位素[s35]UTP,地辛高UTP和生物素UTP三種cRNA探針，在下丘腦旁室核單個(gè)神經(jīng)原細(xì)胞中檢出促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(Corlicotropin releasing factor)、精氨酸后葉加壓素(Arginine vasopressin)和Peptidylycin, αamidating monooxygenase mRNA。在一張組織切片中進(jìn)行多種RNA雜交的目的是研究某個(gè)細(xì)胞與相關(guān)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平，以及它們之間相互聯(lián)系，有重要應(yīng)用價(jià)值。切片在10μm以上，在組織前處理，預(yù)雜交以后，可將幾種雜交探針同時(shí)加入進(jìn)行雜交，然后按各種標(biāo)記的要求作免疫反應(yīng),并以不同方法依次顯色，是難度極高的RNA原位雜交。 (陸良勇) 參考文獻(xiàn)1. 金冬雁 黎孟楓等譯 侯云德等校 分子克
隆實(shí)驗(yàn)指南第二版 科學(xué)出版社，1993.2. 汪謙 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 人民衛(wèi)生出版社，1997，P72－1023. 盧圣棟主編 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。北京：高等教育出版社，1993，p2254. 蔡文琴，王伯云主編 實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù)，成都：四川科學(xué)技術(shù)出
版社，1994，p4065. 陸良勇 黃偉達(dá) 劉尚廉 生物素及地高辛標(biāo)記的ER mRNA、PR mRNA探針的制備和用于
檢測(cè)乳腺癌 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 1997 ,13(增1),102103.6. Boehringer Mannheim Nonradioative in situ hybrization application manual Seco
nd edition Printed in Germany 1996 P116157.7. Dijkman, H. B. P. M.。Mentzel, S.。 de Jong, A. S.。 Assmann。 K. J. M. RNA In S
itu hybridization using digoxigeninlabeled cRNA probes. Biochemica (worldwide v
ersion) No. 2 1995,2125.8. Liu JingYao, Lei WeiHong, Brody A R and Hoyle G W. Investigation of tissu
e preparation conditions for nonradioactive in situ hybridization: localization
of transforming growth factor( message in rat kidney. Histochemical Journal 1
998, 30, 793798.9. Le G P, Dumas S, Volle G E, Pidoux E, Moukhtar M S amp。 Treilhou L F. An efficie
nt method to detect calcitonin mRNA in normal and neoplastic rat Ccells (medull
ary thyroid carcinoma) by in situ hybridization using a digoxigeninlabeled synth
etic oligodeoxyribonucleotide probe. J. Histochem. Cytochem. 1993 41, 38995.10. Mari(tte P. C, Corput V D, Dirks R W, Gijlswijk R P M, Binnendijk E V, et al
: Seneitive mRNA detection by fluorescence in situ hybridization using horseradi
sh peroxidaselabeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification. T
he Journal of Histochemistry amp。 Cytochemistry 1998, 46(11): 12491259.11. Yang Hui, Wanner I B, Roper S D, and Chaudhari N. An optimized method for in
situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare
mRNAS. The Journal of Histochemistry amp。 Cytochemistry 1999, 47(4): 431445.12. Speel E J M, Hopman A H N, and Komminoth P. Amplification methods to increas
e the sensitivity of in situ hybridization: play CARD(S). The Journal of Histoch
emistry amp。 Cytochemistry 1999, 47(3): 281288.13. Speel E J M, Ramacekers F C S, Hopman A H N, Sensitivity multicolor fluoresc
ence in situ hybridization using catalyzed reporter deposition (CARD) amplificat
ion. The Journal of Histochemistry amp。 Cytochemistry 1997, 45: 14391446.14. Chao J, DeBiasio R, Zhu Z, Giuliano KA, Schmidt BF: Immunofluorescence signa
l amplification by the enzymecatalyzed deposition of a fluorescent reporter subs
trate (CARD). Cytometry 1996 23:485315. Kerstens HM, Poddighe PJ, Hanselaar AG: A novel in situ hybridization signa
l amplification method based on the deposition of biotinylated tyramine. J Histo
chem Cytochem. 1995 43:34735216. Schmidt BF, Chao J, Zhu Z, DeBiasio R, Fisher G: Signal amplification in the
detection of singlecopy DNA and RNA by enzymecatalyzed deposition (CARD) of th
e novel fluorescent reporter substrate . J Histochem Cytochem. 19
97 45: 365373.17. Schbfer C, Weipoltshammer K, Almeder M, Wachtler F: Signal amplification at
the ultrastructural level using biotinylated tyramides and immunogold detection.
Histochem Cell Biol. 1997, 108: 313319.18. Speel EJ, Ramaekers FC, Hopman AH: Sensitive multicolor fluorescence in situ
hybridization us