【正文】 度都
會影響雜交結(jié)果，當去離子酰胺濃度高于或低于47％，應加ddH2O調(diào)整，并根據(jù)Longetal
1992年報導，計算去離子甲酰胺百分比公式為： %dF=％GC＝寡核苷酸G＋C鹼基量的百分比，L＝寡聚核苷酸探針長度，％mismatch＝寡核苷酸不能與靶核苷酸配對鹼基的百分比，47＝雜交溫度＋10℃(在37℃下)。短寡核苷酸與靶序列形成的雜交體極易解體，雜交后漂洗必
須盡快進行。(五)雜交抖去甩干雜交溶液，用DAKO魔筆沿組織周圍劃圈，滴加30μl 探針雜交液/每張切片(內(nèi)含20ng地高辛標記的探針)，在44℃ 濕盒內(nèi)孵育過夜。(四)預雜交1. 將DEPC處理的切片經(jīng)ddH2O漂洗 25min。特定序列的單一寡核苷酸探針，能與靶mRN
A區(qū)段的部分序列完全或基本相配對，其長度為1924核苷酸。蛋白酶K須用蛋白酶K緩沖液配制(，50mmol/L EDTA，經(jīng)高壓滅菌后備用)，蛋白酶K應新鮮配制，低溫冰箱內(nèi)分裝保存。(二)雜交的預處理1. 在37℃ 恒溫箱內(nèi)干燥切片后，滴加 510μg/ml蛋白酶K，置37℃ 濕盒內(nèi)孵育30min， ddH20 35min 或 4℃75％ 酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。2. 將外科或動物實驗切取標本切成≤，或用
4％ 多聚甲醛（)或中性福爾馬林（ddH2O配制， PH )
固定，固定時間以2436小時為宜，避免RNA降減或固定過度。ER %%，ER %，ER %。冰凍切片中RNA原位雜交， ER %(11/17)，PR %(10/17),
而Northern雜交中ER %(13/17)、PR %(11/17)。四、用寡核苷酸探針檢測組織切片中的RNA原位雜交用寡核苷酸探針檢測組織切片中相關(guān)的mRNA(靶核苷酸)是較為常見的RNA原位雜交。(3)如果顯色液中用1mmol/L左旋咪唑的濃度，仍然發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性磷酸脂的活性較高（背景色）
，左旋咪唑的濃度可以增加到5mmol/L。(11)用自來水洗210min。(7) 每張切片200μl顯色液，在黑暗條件下顯色224小時。(3)抖去封閉液，每張切片加羊抗地高辛抗體AKP結(jié)合物30μl (Buffer ％ Triton X100,1% 正常羊血清, 羊抗地高辛抗體AKP結(jié)合物)在溫盒內(nèi)2小時。注意事項在同一容器中不能同時放入含不同探針切片。(五)雜交后處理(1)揭去雜交罩將切片浸泡于2SSC中5 10min。(2)瀝干后用雜交緩沖液漂洗，并沿組織周
邊擦干，每張切片滴加30μl探針雜交液(內(nèi)含510ng非同位素標記cRNA探針)。(2)由于醋酸酐極不穩(wěn)定，宜將醋酸酐在使用前加到TEA緩沖液中。(6)再用DEPC 處理的PBS沖洗切片25min。(3)用DEPC處理的PBS漂洗25min。RNA探針的水解：按以下方法減少探針長度為近200bp，在Microcentrifuge 管內(nèi)加入50μl RNA探針標記液，加入30μl 200mmol/L Na2CO3 和20μl 200mmol/L NaHCo3。②在20℃ 孵育4
16小時。
用EDTA緩沖液和DEPC處理的ddH2O將會影響RNA多聚酶中的質(zhì)粒。(2)標本盡可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰凍切片，這一制備法既能避免mRNA降解，又
能保持良好的組織形態(tài)。(2)
立即投入4% 多聚甲醛溶液內(nèi)(PBS新配制),％ 戊二醛，在室溫下固定34小時。(2)立即投入4％ 多
聚甲醛溶液中（PBS新配制），4℃ 下固定24小時。另外雜交體中GC的百分比，雜交體長度以及雜交液中Na+的濃度也與Tm呈正相關(guān)。保持雜交液不流失的關(guān)鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應用雜交罩等也很必要。 2. 探針的長度原位雜交反應中探針濃度應超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為
背景著色度高低與探針濃度有關(guān)。(2)在室溫中加入下列試劑終止水解：3mol/L醋酸鈉，()，(%)。在常溫下將組織浸泡4
小時，每1小時在真空下吸干10分鐘，再注入新的固定液，共4次，然后用50％ 酒精漂洗2次，每次30min。交聯(lián)固定劑能較好保存組織中RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但固定時間過長，也可發(fā)生胞漿和胞核內(nèi)大分子化合物形成交聯(lián)，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。常用的化學固定劑可分為，沉淀固定劑和交聯(lián)固定劑兩類。40℃ 烤箱內(nèi)干燥切片2小時后儲存在80℃ 或140℃ 超低溫冰箱內(nèi)備用。為防止RNA迅速降解，標本離體后，應迅速投入4％ 多聚甲醛溶液內(nèi)，置4℃ 冰箱內(nèi)2 4小時。將烘烤后的載玻片浸泡硅烷溶液中60min，用雙蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60℃ 烤箱內(nèi)過夜備用。60℃ 烤箱內(nèi)過夜備用。為防止組織或細胞標本在雜交過程中漂起或脫落，載玻片應涂以粘附劑，大的冰凍或石蠟切
片建議用明膠粘附劑，活檢或較小的標本建議用多聚左旋賴氨酸或硅烷粘附劑。因為酚雖能有效地變性蛋白質(zhì)，但它不能完
全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解1015% 的水，從而溶解一部分ploy(A)RNA。這是因為在探針標記過程中，反應液中仍存在一些未
被結(jié)合到探針中去的剩余dNTP等小分子。這類標記探針必須符合標記物在雜交過程中不丟失，又
不影響雜交反應為條件。依標記物為同位素和非同位素，近年來非同位素標記探針已有了極大的近步。體外轉(zhuǎn)錄常用噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌
體TT7。端或339。(二)探針的標記在RNA原位雜交中，不僅要選擇適當?shù)奶结?，而且還要使探針得到有效的標記。依標記物不同，探針又可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。由于大多數(shù)寡核苷酸序列較短，不需要純
化，組織穿透性極好。因此雜交反應后可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針。2. cRNA探針：是以cDNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄而獲得的。 二、RNA原位雜交中的探針 (一)探針的種類RNA探針是指帶有標記的能與組織內(nèi)相對應的核苷酸序列互補結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。(6)在實驗流程的各個技術(shù)環(huán)節(jié)中熟練運用技術(shù)控制是保證RNA原位雜交成功的必要條件。其次為對外源性基因檢測，以獲得病毒和細菌類型等病原學診斷。RNA原位雜交不同于DNA原位雜交主要有：(1)使用的探針不同：RNA原位雜交中多采用RNA或寡核苷酸探針，因此避免了應用雙鏈DNA探針在雜交反應中存在的兩條鏈之間的復性和第二條鏈的競爭性雜交問題。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內(nèi) RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。10%冰醋酸處理組切片10 min,或在底物顯色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止內(nèi)源性堿性磷酸酶的染色。〖HJ1〗(6)非特異性染色非特異性染色可能會來自探針、組織內(nèi)源性酶、組織細胞、顯色系統(tǒng)等。②陰性對照:用已知不含待測靶核酸序列的組織作對照?，F(xiàn)在大多數(shù)的研究都是采用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶與抗半抗原抗體(或抗生物素蛋白)連接進行檢測。1SSC 42℃洗2次,每次15 min。變性完畢將切片放在冰塊上迅速降溫1~2 min,然后將切片移入濕盒內(nèi)置37℃培養(yǎng)箱雜交60 min。如果用雙鏈cDNA探針檢測,則探針和靶核酸都必須先解鏈,也就是變性。
蛋白酶的濃度及消化時間,視組織種類、固定類型、切片厚度而定,一般使用1 μg/ml蛋白酶K(用含50 mmol/L EDTA的pH80,01 mol/L TrisHCl緩沖液配制),也可用001%蛋白酶BP(用pH80 PE配制)37℃孵育10~30 min。常規(guī)石蠟切片用二甲苯脫蠟3次,每次5 min。置室溫下保存?zhèn)溆?。?組織切片常用的原位雜交標本有石蠟切片、冰凍切片和細胞培養(yǎng)標本。把經(jīng)
過250℃烘烤過的玻片用2% 3氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液處理玻片，有助于組織和載玻片的粘附。1玻片的預處理組織細胞原位核酸雜交主要在載玻片上進行，因此玻片的處理至關(guān)重要。定時抽查切片，鏡檢其顯色情況。(7)緩沖液Ⅰ 15 min2，室溫。(3)05SSC 50℃ 5 min2。2預雜交封閉非特異性雜交位點，加預雜交液20 μl/每張切片，42℃水浴半小時。(6)02 mol/L甘氨酸液：室溫10 min,中止蛋白酶反應。入PBS(含5 mmol/L MgCl2,pH73~74) 5 min2。雜交時需先在高溫80~95℃短時處理，使DNA探針及細胞內(nèi)靶DNA變性，解離成單鏈，迅速置于冰上冷卻。4以不加核酸探針雜交液進行雜交(空白試驗)。1將cDNA或cRNA探針進行預雜交(吸收試驗)。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計或圖象分析儀對不同類型數(shù)量的核酸顯色強度進行檢測。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了
背景染色。RNA探針雜交時產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲
得較好的反差效果。硅
化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑不會產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻
片自身有一定重量能使有限的雜交液均勻覆蓋。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫(240
℃)烘烤以達到消除RNA酶的目的。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于
前者不含探針和硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)。3減低背景染色背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。一般應用蛋白酶K 1μg/ml(于01 mol/L Tris/50 mmol/L EDTA,)，37℃孵育15~20 min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。一種新的粘附劑APES粘附效果好，價格較多聚賴氨酸便宜，
制片后可長期保存應用。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。其它固定劑如應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲滿意效果。4組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10 min，空氣干燥后保存在70℃。在解釋結(jié)果時應考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。第二節(jié) 原位分子雜交技術(shù)的基本方法原位雜交技術(shù)的基本方法包括：①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何
增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示(visualization
)：包括放射自顯影和非放射性標記的組織化學或免疫組織化學顯色。所以原位雜交可分為DNADNA，cDNARNA,RNARNA和寡核苷酸探針與DNA或RNA等雜交方式。同時在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標記技術(shù)要優(yōu)越，地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色(標記堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng))，有較好的反差背景，更有利于與免疫組織化學相結(jié)合，同時可以檢測基因表達。Bauman(1981)等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。第一節(jié) 原位核酸分子雜交技術(shù)的發(fā)展原位雜交1969年美國耶魯大學Gall和Pardue首先創(chuàng)立的，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中?？梢暈榻M織化學或免疫細胞化學中革命性的突破。這一技術(shù)為研究單一細胞中DNA和編碼各種蛋白質(zhì)、多肽的相應mRNA的定位提供了手段，使從分子水平研究細胞內(nèi)基因表達及有關(guān)基因調(diào)控提供了有效的工具。隨著核酸探針的制備,標記方法和基本操作方法的不斷改進,新的技術(shù)不斷涌現(xiàn),相信在不久的將來,原位雜交技術(shù)將會更廣泛的被應用于各個學科,并不斷為生命科學提供新的資料,開拓新的領(lǐng)域。由于同位素標記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等特點，因此研究用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交，引起了許多學者的重視和探索。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年將地高辛標記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場，和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統(tǒng)安全，方便、省時間。DNA探針還有單鏈DNA(Single stranded,ssDNA)和雙鏈DNA(Double stranded,dsDNA)之分。為各個學科的研究帶來突破性的進展.。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，取材后應盡快予以冷凍或固定。3mRNA的定位將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1~2 h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。(二)玻片和組織切片的處理1玻片的處理玻片包括蓋片和載玻片應用熱肥皂水刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24 h，清
水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24 h后蒸餾水沖洗、烘干、烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。多聚賴氨酸液具
有較好的粘附效果，但價格昂貴。蛋白酶K(Proteinase K)的消化作用的濃度及孵育時間視組織種類、應用固定劑種類、切片的厚薄而定。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。預雜交(Prehybridizaiton)是減低背景染色的一種有效手段。4防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃皿上均可能有RNA酶，為防止其污染影響實驗結(jié)果，在整個
雜交前處理過程都需戴消毒手套。在蓋玻片周圍加液體石蠟封固或加橡皮泥封固。特別因為大多數(shù)的原位雜交實驗
是在低嚴格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色
。必須注意的是漂洗的過程中
，切勿使切片干燥。細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計
算機輔助的圖象分析檢測儀(puterassisted image analysis)檢測銀粒的數(shù)量和分布
的差異。(六)對照實驗和結(jié)果的判斷對照試驗的設置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定，常用的對照試
驗有下列幾種。應用同義RNA探針(Sense probe)進行雜交。第三節(jié) 原位DNA和DNA分子雜交方法D