【正文】 對性地、合理地使用這類先進(jìn)手段。四、免疫組化試劑的標(biāo)準(zhǔn)化試劑的標(biāo)準(zhǔn)化，首先要求使用正規(guī)免疫試劑公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化試劑，并附有詳細(xì)的試劑說明書，包括：抗體的來源、免疫球蛋白的亞類、單抗或多抗、使用的稀釋度、使用流程和注意事項、洗滌時緩沖液的適宜離子濃度和PH值等。即使廠家提供了相應(yīng)的資料，在使用時亦不能一成不變地生搬硬套。因為廠家提供的標(biāo)本固定和組織處理等程序可能與應(yīng)用者實驗室的程序不完全相同。五、免疫組化常用溶液的配制l、PBS磷酸鹽緩沖液（）配制：NaCL 8gKCL Na2HPO4 KH2PO4 將上述各種試劑溶于800ml水中，用HCL(1N)或NaOH(1N)，加水至1000ml即可。2. TBS:Tris緩沖液配方:( )Tris(三羥甲基氨基甲烷) NaCl 濃HCL 約7ml雙蒸水 加至2000mlTris緩沖液配制方法:先以少量雙蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入7mlHCL后，用HCl（IN）或NaOH（IN），最后雙蒸水加至2000ml。此液為儲備液，4℃冰箱中保存。TBS配方:TrisHCI緩沖液 （ ） 100mnlNaCI ~9g()雙蒸水 加至1000mlTBS配制方法:先以少量雙蒸水溶解NaCl，再加入TrisHCl緩沖液，最后加雙蒸水至1000ml，充分搖勻。3. 枸椽酸鹽緩沖液（Citrate buffer）:儲存液::（）溶于1000ml蒸餾水中。:稱取 )溶于1000ml蒸餾水中，工作液:取9ml A液和4Iml B液加入450ml蒸餾水中，溶液pH值177。4. 胰酶（TrypsIn）:胰蛋白酶消化液:%% ，溶解即可。（Pepsin）——％胃蛋白酶： HCL中即可。6. DAB(3，3二氨基聯(lián)苯胺):6mg DAB溶于l0ml （ ）,%的H2O2，過濾掉沉淀物，即可。7. AEC:4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，()， 3%H2O2，過濾掉沉淀物。六、免疫組化結(jié)果的判斷首先應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照，其次，陽性信號的存在部位必須與抗原分布相一致。如：T細(xì)胞系惡性淋巴瘤組織中，存在著CD20標(biāo)記陽性的細(xì)胞，這是因為瘤組織中散在分布著正常的反應(yīng)性B細(xì)胞系免疫細(xì)胞。只有腫瘤細(xì)胞陽性才能明確腫瘤的組織來源。需注意的是任何一種特異性標(biāo)記物并非絕對特異，且敏感性也有一定限度。腫瘤的分化程度和惡變導(dǎo)致的表型改變均影響標(biāo)記物的表達(dá)。多數(shù)抗原在組織中的分布是不規(guī)則的，即使在成團(tuán)陽性細(xì)胞中，表現(xiàn)也可為強(qiáng)弱不一，甚至其間含有散在或成團(tuán)的陰性細(xì)胞，這些都是正常的。因此，在結(jié)果判斷有困難或幾種免疫組化顯示矛盾結(jié)論時，應(yīng)重復(fù)染色，不可勉強(qiáng)下結(jié)論。染色結(jié)束后，應(yīng)先觀察對照組的結(jié)果。如陽性對照呈強(qiáng)陽性，陰性對照呈陰性，背景無非特異性染色時，表明本次實驗的全部試劑和全過程技術(shù)操作準(zhǔn)確無誤，待檢組織中的陽性細(xì)胞就是可信的正確結(jié)果。關(guān)于陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，目前國際上存在兩種以上報告方式，一種是根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比來分級；一種是根據(jù)陽性細(xì)胞的染色深度來分級；還有將兩者結(jié)合起來分級的。這需要根據(jù)檢測項目來區(qū)別對待。一般DAB顯色陽性應(yīng)為棕黃色、棕色或棕褐色。而黃色的淺淡背景不應(yīng)視為陽性。當(dāng)然，結(jié)果的判斷還要考慮到固定液、固定方法、抗體的特性、效價、免疫組化方法的敏感性等因素。其他的結(jié)果既要與普通病理組織學(xué)相結(jié)合，又要防止各種主觀因素和各取所需的思維影響。七、免疫組化結(jié)果中常見問題的處理 當(dāng)免疫組化染色沒有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種原因。對照標(biāo)本和目標(biāo)標(biāo)本均無著色1. 確認(rèn)是否漏加了某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。2. 確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。3. 對照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。4. 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。 5. 檢查抗體的有效和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗休均要求在4～8℃條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機(jī)溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。6. 查標(biāo)本的儲存條件，最好用巳知陽性的標(biāo)本來同時做陽性對照。7. 檢查色原/底物溶液，最簡單的檢測方法是將一滴標(biāo)記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，否則會失效。8. 檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。9. 檢查復(fù)染劑和封片劑是否和所用的色原匹配。弱陽性如果陰性對照沒有染色而陽性對照標(biāo)本弱陽性，除了考慮上述因素外還應(yīng)考慮:1. 標(biāo)本的固定方式，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。2. 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照生產(chǎn)廠家的說明，同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。 3. 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度，時間是否正確。一般試劑生產(chǎn)廠家都會對試劑給出一定的濃度使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進(jìn)行梯度測試，找出最佳的使用濃度。4. 切片上遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。5. 孵育時切片是否水平放置，否則會導(dǎo)致抗體流失。如果陰性對照沒有反應(yīng)，陽性對照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。6. 除抗體濃度過低，孵育時間過短，試劑超過有效使用期，緩沖液未吸干，造成試劑被稀釋，防止切片干燥外，還有復(fù)染或襯染太深，室溫太低，低于15℃，組織經(jīng)固定和包埋等處理后抗原丟失嚴(yán)重；雖然環(huán)境溫度4～20℃，但過度血清蛋白封閉等原因也可影響結(jié)果。7. 染色陰性有操作步驟錯誤，組織中無抗原，一抗與二抗種屬連接錯誤和試劑失效等原因。 非特異性染色1. 是否有效地去除了內(nèi)源性酶和內(nèi)源性生物素。應(yīng)注意的是，并不是每一種組織均需要進(jìn)行此步驟，但對于內(nèi)源性酶或內(nèi)源性生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處埋的方法為:滅活堿性磷酸酶: 最常用的方法是將左旋咪唑(24mg/ml)加入底物液中，～，即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。飽和處理內(nèi)源性生物素: 消除內(nèi)源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內(nèi)源性生物素，使之不再有剩余的結(jié)合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。2. 是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%～10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常應(yīng)用。另外，取材時避開出血、壞死區(qū)亦極重要。最近有些國內(nèi)的實驗室應(yīng)用5%脫脂奶粉替代血清進(jìn)行抗原封閉，效果也不錯。3. 所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異件染色，只能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。4. 一抗的使用濃度是否過高。5. 清洗是否充分。應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，, ，溶液內(nèi)加入吐溫20效果更佳。特殊標(biāo)記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。6. DAB的使用是否正確。DAB的孵育時間和配制方式可以產(chǎn)生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的PH值，以確保實驗結(jié)果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不容性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉淀于切片上，因此需將DAB保存于閉光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。7. 標(biāo)本染色過程中是否曾經(jīng)干涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。8. 檢查二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有交叉反應(yīng)。9. 另外還有操作過程中沖洗不充分，組織切片折疊，組織中含過氧化物酶未阻斷，組織抗原彌散，切片黏附劑過厚，血清蛋白封閉不充分，在室溫1小時中超過37℃ 降至室溫20～28℃或4℃過夜孵育溫度過高等原因。注意： 請注意陽性對照組織上的陽性率。 只能用丙酮固定。 。 酶消化＋抗原熱修復(fù)。 1mM EDTA修復(fù)液 。 八、免疫組化報告免疫組化報告內(nèi)容應(yīng)包括組織固定方法、一抗的標(biāo)號和種類、免疫組化方法、是否用了附加抗原修復(fù)措施和染色結(jié)果。不應(yīng)簡單地列出各項結(jié)果的陽/陰性。另外，應(yīng)注意免疫組化報告不應(yīng)與病理組織學(xué)診斷報告分離，而應(yīng)與特殊染色、組織化學(xué)染色報告一樣，成為最后病理診斷報告有機(jī)的組成部分（可合并到病理診斷報告中）。九、免疫組化工作程序1. 初診醫(yī)師根據(jù)常規(guī)HE切片診斷中遇到的問題，提出免疫組化的抗體標(biāo)記類型，交上級醫(yī)師核準(zhǔn)。2. 針對診斷難點，及免疫組化標(biāo)記的抗體種類，并填寫免疫組化工作單，交免疫組化技術(shù)室。3. 免疫組化室染好切片后，經(jīng)質(zhì)控檢查合格（即染色程序無誤、對照染色可靠）交給初診醫(yī)師。4. 初診醫(yī)師根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，提出初步的診斷，交上級醫(yī)師復(fù)查。5. 上級醫(yī)師復(fù)查后，發(fā)出最后報告，并附上免疫組化結(jié)果。6. 據(jù)臨床醫(yī)師提出的免疫組化申請，完成各項檢查。7. 報告發(fā)出后，將切片送回免疫組化室歸檔。十、免疫組化技術(shù)常規(guī)1. 抗體的合理保存：各類抗體有其各自的保存條件，一定要按其說明保存。對每一種新購進(jìn)的抗體要進(jìn)行效價測定，并確定最佳稀釋度。稀釋抗體時，所用的器皿要潔凈，防止影響抗體效價。此外，自己稀釋的抗體要在短時間內(nèi)用完。（最好一周內(nèi)用完，最長不宜超過兩周：用抗體稀釋液，稀釋一抗，可保存3個月至一年）2. 染色前準(zhǔn)備（1）填寫申請單：常規(guī)外檢中需做免疫組化檢查的病例，首先由醫(yī)師將申請單送免疫組化室。（2）登記：免疫組化室備專門的工作登記本，對所需染色的每一例標(biāo)本進(jìn)行登記，以便歸檔和日后查找。（3）切片：4um厚，切片放置于60～62℃烤箱烤片2小時。（4）染色：按常規(guī)方法染色（詳見染色方法）。（5）發(fā)片：染色后的切片送給初診醫(yī)師。（6）歸檔：病理醫(yī)師閱片后，及時將切片送回免疫組化室，統(tǒng)一歸檔。十一、免疫組織化的應(yīng)用范圍在常規(guī)病理診斷中應(yīng)用免疫組化主要有以下八個方面的意義：1. 對腫瘤的組織起源進(jìn)行鑒別分析和確定診斷。2. 對腫瘤的良、惡性進(jìn)行綜合判斷。3. 發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶。4. 激素受體的檢測，以指導(dǎo)臨床治療。5. 激素類細(xì)胞的定性和定位。6. 指導(dǎo)腫瘤分期。7. 指導(dǎo)腫瘤預(yù)后的判斷。8. 免疫性疾病的輔助診斷。 第四章 病理科常見技術(shù)問題及常用特染、試劑配制一、脫鈣問題一些組織含有鈣，含鈣的組織不宜直接用石蠟包埋切片。骨組織含鈣最多，其它組織也可發(fā)生鈣化，在組織中形成鈣化區(qū)。對含鈣的組織在組織脫水處理之前應(yīng)先進(jìn)行脫鈣處理，然后再進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。用于脫鈣的試劑很多，在脫鈣劑中沒有一種是比較完美的。強(qiáng)酸如硝酸和鹽酸可用于密皮質(zhì)骨的脫鈣，在短時間內(nèi)可除去大量的鈣。但需注意這些強(qiáng)酸會損壞組織形態(tài)，控制脫鈣時間，尤其是骨髓組織。二、組織切片中的人為現(xiàn)象在切片染色中出現(xiàn)的一些人為現(xiàn)象可能是由于組織固定不適當(dāng)，固定劑類型不合適，脫水和浸蠟不夠，試劑不適當(dāng)，切片刀不鋒利和切片機(jī)性能較差所造成的。經(jīng)常切片上出現(xiàn)一種細(xì)黑色沉淀物與組織無關(guān)（例如，沉淀物出現(xiàn)在組織的邊緣，組織間隙及血管內(nèi)）提示形成了福爾馬林色素。福爾馬林色素用偏光顯微鏡可以進(jìn)一步證實。因為這種