【正文】 顯改善，從而為抗體更廣泛地應(yīng)用于疾病的治療提供了基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，不少PEG修飾蛋白藥物已經(jīng)上市或者進(jìn)入臨床。另外，掩蔽多肽分子的末端羧基或/和氨基基團(tuán)，也可以對抗外肽酶，減少水解作用。多糖和白蛋白作為化學(xué)修飾劑也有成功范例：用于治療血栓的葡聚糖鏈激酶已在俄羅斯上市；白蛋白已作為多種蛋白藥物的載體，白蛋白SOD半衰期由5min提高到6h；白蛋白GH半衰期由5min提高2～3h，將rhGCSF通過異雙功能試劑聚乙二醇與白蛋白共價偶聯(lián)，使GCSF的體內(nèi)清除速度降低約6倍。也有將蛋白藥物與抗體偶聯(lián)來延長藥物半衰期的報道。但是化學(xué)修飾是完全隨機(jī)的，帶來的產(chǎn)物不均一性及藥物活性的降低似乎是不可避免的，為此有人提出采用酶法進(jìn)行位點特異性修飾。對于修飾劑的活化方法、修飾位點、修飾率、修飾反應(yīng)時間等都需要深入研究。 基因融合通過基因融合技術(shù)增加多肽和蛋白藥物分子量或改變與受體的親和性等原理延長藥物半衰期。人血清白蛋白(HSA)是現(xiàn)有天然載體蛋白之一，并且是血液中含量最高的單一蛋白(達(dá)40g/L)，是人體血漿的主要成分，在體內(nèi)有維持血液滲透壓，運(yùn)輸營養(yǎng)和其它重要生物物質(zhì)的作用，具有無免疫原性，人體相容性好，分子量大(約為66kDa)，半衰期長(達(dá)兩周)等穩(wěn)定劑和多肽運(yùn)載蛋白的必需性質(zhì)，它已成功地在哺乳動物細(xì)胞和酵母中實現(xiàn)高效表達(dá)。日本Green Cross公司酵母表達(dá)的HSA 已完成Ⅲ期臨床實驗和規(guī)?；a(chǎn)的準(zhǔn)備，臨床實驗證明酵母表達(dá)的HSA與天然的HSA在效果和安全性方面完全一致。1990年英國delta公司首先將白蛋白用于基因融合提高多肽、蛋白藥物的半衰期，1997年申請了HSA與人生長激素(HGS) 的融合蛋白的專利。美國Yeh 等將CD4 與HSA 融合表達(dá)，HASCD4 融合蛋白在小鼠體，內(nèi)半衰期較CD4 延長140 倍，使其半衰期與HSA 相似。2001 年美國HGS 公司研制的HSA 與α2干擾素、人生長激素、IL2的融合蛋白分別進(jìn)入臨床試驗，其中人生長激素臨床前數(shù)據(jù)表明其體內(nèi)清除速率較融合前降低了50倍。用于治療血小板凝集的73個氨基酸的毒液肽Barbourin 與白蛋白融合后清除率較Barbourin 明顯降低且活性保持較好，水蛭素融合白蛋白后不僅延長了藥效，且增強(qiáng)了其生物學(xué)活性。利用抗體Fc段所特有的生物學(xué)功能與某些多肽或蛋白融合可增加該蛋白的血漿半衰期，一般采用引入重鏈穩(wěn)定區(qū)(Cγ2或Cγ4)構(gòu)建融合蛋白，例如IL10是一種抗炎癥因子，制備重組IL10/IgGFc融合蛋白能明顯延長IL10的半衰期。Chamow等制備了CD4/IgG，包括CD4的V1，V2結(jié)構(gòu)域，人Ig重鏈鉸鏈區(qū)及Fc段，已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗。酵母表達(dá)的抗體單鏈Fv段(scFv)與抗體Fc(人IgG1片斷)融合蛋白以二聚體形式在培養(yǎng)上清中，scFv段分子量由原來的25kDa增至106kDa。據(jù)報道scFv片斷具有抗蛋白酶降解的作用，與L2天冬酰胺酶融合后L2天冬酰胺酶半衰期由2h延長至9h。IL2，GMCSF，TNF，CD4，TNFR 等與抗體片斷融合后半衰期都有不同程度的增加，其中TNFR與IgG1(Cγ1)融合蛋白已經(jīng)美國和歐洲批準(zhǔn)上市。除了利用蛋白載體基因融合外有些細(xì)胞因子之間融合也可以實現(xiàn)藥效的延長，促血小板生成素(Tpo)富糖基化的C端在體內(nèi)可能有穩(wěn)定分子、延長半衰期以提高分子效率的作用，汪治清等構(gòu)建了紅細(xì)胞生成素(Epo)Tpo融合蛋白，初步試驗結(jié)果顯示Epo半衰期由8h增至12h。用基因工程方法生產(chǎn)增強(qiáng)其生物活性的紅細(xì)胞生長因子二聯(lián)體/三聯(lián)體融合蛋白，不僅延長了蛋白體內(nèi)半衰期而且增強(qiáng)了生物功效，減少用藥次數(shù)，有望提高紅細(xì)胞刺激因子的臨床實用價值。融合蛋白基因穩(wěn)定性高，可調(diào)控表達(dá)且制備簡單，產(chǎn)物均一，對蛋白、多肽藥物活性影響小等，是目前研究長效多肽、蛋白藥物的良好途徑。 添加劑 通過加入添加劑，如糖類、多元醇、明膠、氨基酸和某些鹽類，可以提高多肽的穩(wěn)定性。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質(zhì)周圍，因而提高了多肽的穩(wěn)定性。在凍干過程中，上述物質(zhì)還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象，而且還可以提高凍干制品的玻璃化溫度。此外表面活性劑如SDS、Tween、Pluronic，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。 凍干 多肽發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)如脫酰胺、β消除、水解等都需要水參與，水還可以作為其它反應(yīng)劑的流動相。另外，水含量降低可使多肽的變性溫度升高。因此，凍干可提高多肽的穩(wěn)定性。 五、藥理性預(yù)適應(yīng)預(yù)適應(yīng)是指預(yù)先給予某種損傷性刺激后，機(jī)體組織器官對這些有害刺激產(chǎn)生的耐受性或適應(yīng)性。1986年Murry 等首次報道“心肌缺血預(yù)適應(yīng)”現(xiàn)象。缺血預(yù)適應(yīng)有兩個時相，即早期保護(hù)和延遲保護(hù)。保護(hù)作用表現(xiàn)為縮小心肌梗死面積、降低心律失常發(fā)生率、改善心功能和減少心肌酶的釋放等。缺血預(yù)適應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及“觸發(fā)物質(zhì)中介物質(zhì)效應(yīng)子”。缺血刺激引起觸發(fā)物質(zhì)釋放，包括多種內(nèi)源性活性物質(zhì)如腺苷、一氧化氮(NO)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、緩激肽、阿片肽和前列腺素等，作用于各自相應(yīng)受體，在受體水平進(jìn)行調(diào)節(jié)；中介物質(zhì)主要是指受體后多種蛋白激酶如蛋白激酶C(PKC) 、酪氨酸激酶( TPK) 和絲裂素活化蛋白激酶等；效應(yīng)子包括產(chǎn)生最終效應(yīng)的離子通道和細(xì)胞保護(hù)蛋白等。雖然缺血預(yù)適應(yīng)能有效防治心肌缺血再灌注損傷，但這種保護(hù)作用的獲得是以心肌細(xì)胞缺血為代價的?；谏鲜鋈毖A(yù)適應(yīng)保護(hù)機(jī)制的認(rèn)識，人們推測藥物通過促進(jìn)內(nèi)源性活性物質(zhì)釋放或直接作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同環(huán)節(jié)能模擬缺血預(yù)適應(yīng)。已證明多種藥物如硝酸甘油、單磷脂A、腺苷、ATP 敏感性鉀通道( KATP通道) 開放劑、嗎啡、川芎嗪等具有誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)作用，并將藥物替代缺血刺激所產(chǎn)生的預(yù)適應(yīng)稱為藥理性預(yù)適應(yīng)。藥理性預(yù)適應(yīng)以藥物替代缺血刺激，克服缺血損傷弊端，對心肌、大腦等多種器官的缺血性損傷具有保護(hù)作用。 1．硝酸甘油 內(nèi)源性NO與缺血預(yù)適應(yīng)的心臟保護(hù)密切相關(guān)。在應(yīng)用亞硝基精氨酸甲酯(一氧化氮合酶抑制劑)或亞甲藍(lán)(鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑)評價NO與缺血預(yù)適應(yīng)的實驗中，結(jié)果顯示無論抑制NO合成還是阻斷其作用均可取消犬心肌缺血預(yù)適應(yīng)的心肌保護(hù)作用。硝酸甘油是經(jīng)典抗心絞痛藥，在體內(nèi)代謝釋放NO 而發(fā)揮保護(hù)作用。2．單磷脂A(monophosphoryl lipid A ，MLA) MLA 是從內(nèi)毒素中分離出的一種低毒成分。Elliot 等在犬和家兔實驗中證明，MLA 能誘導(dǎo)延遲保護(hù)，其作用與促進(jìn)誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)，促進(jìn)NO 合成，最終活化KATP通道而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。同類物雙磷脂A 也能誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)，顯著減輕腦缺血損傷。3．腺苷 腺苷是介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)的重要內(nèi)源性活性物質(zhì)。臨床研究證明，腺苷能顯著提高冠脈搭橋術(shù)或冠脈成形術(shù)患者心肌耐缺血能力，促進(jìn)術(shù)后心功能的恢復(fù)，減少ST 段上移，顯著減輕胸痛癥狀。雙嘧達(dá)莫能抑制內(nèi)皮細(xì)胞對腺苷的攝取和代謝，增高血中腺苷濃度，雙嘧達(dá)莫預(yù)適應(yīng)能顯著減輕肝臟缺血再灌損傷。腺苷受體存在數(shù)種亞型，已在多種動物模型和臨床病人證明AA3 受體在缺血預(yù)適應(yīng)中起重要作用。腺苷作用于受體，激活PKC，開放KATP通道，縮短動作電位時程，減少Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。4．ATP 敏感性鉀通道開放劑鉀通道開放劑是八十年代初發(fā)現(xiàn)的一類能特異促進(jìn)膜內(nèi)K+ 外流的藥物，主要作用于KATP通道的藥物包括吡那地爾、尼可地爾、克羅卡林、二氮嗪等。KATP通道是缺血預(yù)適應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要效應(yīng)子。一系列動物實驗和臨床研究證明KATP通道開放劑能模擬預(yù)適應(yīng)，如Bimakalin 可顯著縮小犬心肌梗死面積；吡那地爾和尼可地爾在兔心肌能產(chǎn)生缺血預(yù)適應(yīng)類似的保護(hù)作用；在人的離體心房肌，克羅卡林和尼可地爾能預(yù)防經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈成形術(shù)( PTCA) 時心肌缺血損傷。5．嗎啡與阿片肽類藥物 心肌缺血預(yù)適應(yīng)與內(nèi)源性阿片樣肽有關(guān)，這已被納洛酮(非選擇性阿片受體阻斷劑) 能取消心肌缺血預(yù)適應(yīng)所證實。外源性嗎啡可模擬預(yù)適應(yīng)，格列本脲取消嗎啡這一作用，表明嗎啡誘導(dǎo)的心肌預(yù)適應(yīng)也涉及KATP通道開放。DPDPE(δ阿片受體激動劑) 能增強(qiáng)小鼠對低氧的耐受力，該作用可被BN2TX(選擇性δ1阿片受體拮抗劑) 取消，但不被naltrindole (δ2阿片受體拮抗劑) 取消，提示阿片類藥物的預(yù)適應(yīng)是由δ1受體介導(dǎo)而非δ2受體介導(dǎo)。保護(hù)作用是由Gi/o蛋白和KATP通道介導(dǎo)，因為其保護(hù)作用可被格列本脲和PTX完全取消。 (第三軍醫(yī)大學(xué) 張海港 李曉輝)18 / 1