【正文】 ，室溫保存；Solution C：Tris Base ，SDS ，HCl 調(diào)節(jié) pH 至 ，加水至100ml，室溫保存；各濃度類型的 SDS 膠的配方：分離膠10% % 15% 堆積膠Solution A (ml) 5 Solution B (ml) /Solution C (ml) / / / 1ddH2O (ml) 10% 過硫酸銨(μl) 40 40 40 20TEMED (μl) 10 10 10 10不同濃度 X％分離膠的配制公式：A 液 X/3ml，B 液 ，ddH 2O（）ml，10%過硫酸銨27 / 3250μl， TEMED 10μl，總量 10mlSDSPAGE 分離膠濃度 最佳分離范圍6%膠 50～150kD 8%膠 30～90kD 10%膠 20～80kD12%膠 12～60kD 15%膠 10～40kD9) 5Loading Buffer（10ml）： 1mol/L 的 TrisHCl()，3ml 甘油，2ml 10％的 SDS（+15ml 雙蒸水） ， （ β巰基乙醇，1ml 1％溴酚藍） ，加蒸餾水補足 10ml（加 雙蒸水） 。分裝 205ul/管。10) 考馬斯亮藍膠用染色液：%考藍 G250，40 ％甲醇，10％醋酸（可回收） 。11) 脫色液：45％甲醇，45％去離子水，10％醋酸。12) 轉(zhuǎn)移緩沖液： Tris Base， 甘氨酸，200ml 甲醇（用前加入， 易揮發(fā)） ，加去離子水至 1L，于 4℃保存。13) 麗春紅 S 染色液：%麗春紅 S，3％三氯乙酸，3％磺基水楊酸，室溫保存。14) 封閉液：10％脫脂奶粉PBST (Tween20 %%，用前加入)15) 抗體稀釋劑：5％BSAPBST16) 其他：顯影粉，定影粉，紅燈泡購自照相器材店；蛋白Marker，PVDF 膜（ 適合 20KD 以下的蛋白） ，Whatman 濾紙，X光片（感綠光） ，化學發(fā)光劑2. 儀器低溫高速離心機，恒溫水浴鍋，BIORAD 垂直電泳槽，搖床，暗盒，封口機，等3. 實驗步驟1) 提取蛋白① 胰酶消化后，冷 PBS 輕輕蕩洗 2 次，以去除胰酶，加入適量冷 PBS吹打細胞收集至離心管中，1000rpm5min ；28 / 32② 棄上清，加入 1ml 冷 PBS 重懸細胞至 道夫管中，2022rpm5min（冷 PBS 洗細胞 2～3 次） ；③ 棄上清，加入冷的 lysis buffer（使用前加入 PMSF 至終濃度100μg/ml） ，每 106 細胞約加入 60μl lysis buffer，在冰上孵育30min，4℃ 12022 rpm5min。[內(nèi)皮細胞長滿一個 75ml 的培養(yǎng)瓶約加入 30～50μl 的 lysis buffer]④ 可以看到離心管底部有粘稠的白色的沉淀，小心的吸出上清的蛋白溶液至一個新的小道夫管中，注意不要吸入沉淀。2) 蛋白定量（也可以用碧云天的 BCA 蛋白定量試劑盒定量）Bradford 儲存液：100ml 95％乙醇，200ml 85％磷酸，350mg 考藍 G。室溫下長期保持穩(wěn)定。Bradford 工作液：425ml 雙蒸水，15ml 95％乙醇，30ml85％磷酸，30ml Bradford 儲存液。Whatman 濾紙過濾，保存于室溫棕色瓶中，可使用數(shù)周。① 精密配制 1mg/ml 的 BSA－PBS 溶液；② 分別吸取 0，20，40，60，80，100μl 的 1mg/ml 的 BSAPBS 溶液于試管中（平行做兩組） ；③ 相應加入 100，80，60，40，20，0μl 的 PBS 溶液于試管中；④ 每管加入 1ml 的 Bradford 工作液，搖勻；⑤ 吸取 100μl 于 96 孔板中測定 A595 值（每管平行操作 2 次，5min 中內(nèi)完成以上操作） ；⑥ 求平均值；⑦ 做標曲；⑧ 空白 lysis buffer 10μl 加入 90μl 的 PBS，加入 1ml 的 Bradford 工作液，測定 A595 值（每管平行操作 2 次） ；⑨ 提取的蛋白 lysis buffer 10μl 加入 90μl 的 PBS，加入 1ml 的 Bradford工作液，測定 A595 值（每管平行操作 2 次） ；⑩ 蛋白 lysis buffer 減去空白 lysis buffer 的值代入標曲求出蛋白濃度。29 / 323) 制膠和電泳① 根據(jù)所需濃度配制分離膠，加入玻璃板中至綠框中間，加水封住液面（加水時要輕柔，否則液面會被沖凹陷不能恢復） 。室溫靜置約40min 膠凝，此時可看到分離膠和水之間有明顯的界面。② 配制堆積膠，取出水相，加入堆積膠，不要有氣泡，立刻插入梳子，待膠凝后放入電泳槽中加入電泳緩沖液，拔出梳子。③ 取約 30～50μg 蛋白樣品加入 Loading Buffer，注意每孔上樣不超過20μl，在沸騰的水浴中放置 5～10min（最好蛋白道夫管于水浴同時加熱，否則直接投入沸水中會崩開管蓋而倒置進水） 。④ 短暫離心，甩干管壁外水滴和甩下管壁內(nèi)的蛋白樣品。⑤ 向加樣孔中加入蛋白樣品與 Marker，不加樣的泳道加入上樣緩沖液。⑥ 樣品在濃縮膠中時用 6080V，溴酚蘭前沿進入分離膠后用 120150V恒壓電泳（電泳時間一般 2～4 h，視電壓而定） 。⑦ 當溴酚蘭前沿剛跑出凝膠時停止電泳（若是下步轉(zhuǎn)膜做大分子量的蛋白質(zhì)則等所需蛋白跑至中間停止，若是做小分子也是） 。⑧ 在有水潤濕的環(huán)境下翹開玻璃板，在膠的一端切角做記號。⑨ 考馬斯亮藍染色 4h 以上，去除染液自來水沖洗，加入脫色液搖洗，更換脫色液至膠變得透明，條帶明顯。4) 轉(zhuǎn)膜（濕法）① （大轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）Transfer Buffer 置 4℃預冷去除氣體。② 取出膠，去掉多余的膠（膠范圍最好相應切大些） ，切角做好標記，測量大小后浸入 Transfer buffer 中 30min（大分子蛋白轉(zhuǎn)膜可省浸泡，直接做） 。③ 切取小于膠的小的濾紙 6 張侵入 Transfer buffer 中 15min。④ 剪下小于膠的大小的 PVDF 膜（只要能覆蓋所需的蛋白即可） ，與膠對應處切角做好標記，在甲醇中浸 5min，蒸餾水浸泡洗滌使膜呈親30 / 32水狀并透明，泡入 Transfer buffer 中 15min，切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜（NC：水浸泡 2h，泡時使膜浮于水上，下層與水接觸） 。⑤ 浸泡纖維墊。⑥ 打開夾子，在黑面依次覆蓋纖維墊－濾紙3－膠－膜（2：觀察是否穿膜，或做小分子蛋白）－濾紙3－纖維墊，注意不要有氣泡，壓緊（最好是膠或膜大一點，膜兩邊的濾紙一定不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路?。?。⑦ 合上夾子，黑面朝向轉(zhuǎn)膜槽黑面放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)子放入鋁飯盒中放在攪拌器 加入冷卻裝置電泳。⑧ 100V 恒定電壓轉(zhuǎn)移 40～60min（Actin 的轉(zhuǎn)膜時間約為50min，200KD 的大分子量蛋白轉(zhuǎn)膜時間可增至 90min） ，電流為 左右，過高的電流產(chǎn)生的熱量會使熱量，因此最好在冰柜里進行。⑨ 取下膜在麗春紅染液中浸泡 10min，用蒸餾水吸去浮色；膠則放入考馬斯亮藍染色觀察轉(zhuǎn)移效率。5) 免疫標記與顯影① 將膜裝入用封口機做好的小袋中，加入封閉液（約 2～3ml） ，室溫封閉 ，或 4℃過夜。② 取出膜用 PBST 洗膜 2～3 次，5min/次。③ 將一抗用抗體稀釋液稀釋（不同的抗體稀釋比例不同，可參考抗體說明書，如 actin（博士德）為 1：400） ，加入裝有膜的封口袋中（約31 / 322～3ml） ，4℃過夜。④ 取出膜用 PBST 洗膜 2～3 次，5min/次。⑤ 將 HRP 標記的二抗用抗體稀釋液稀釋（博士德 1：3000） ，加入裝有膜的封口袋中（約 2～3ml） ，室溫 1h。⑥ 取出膜用 PBST 洗膜 2～3 次，5min/次。⑦ 暗室中，紅燈下，裁出比膜稍大的 X－光片。⑧ 將 ECL 試劑盒的 A 液與 B 液等體積混合（盡量節(jié)約試劑，能覆蓋膜即可） ，加在有蛋白的一面的膜上，1～2min。⑨ 吸水紙吸干膜上的底物，加入塑料薄膜中，有蛋白的一面朝上放入暗盒中，在膜上覆蓋 X－光片，切記一旦放上勿挪動光片。⑩ （有毒！）將膜在顯影液中浸泡 5s～1min（顯影時間需根據(jù)具體情況而定，20～25℃溫度過低時需延長時間） ，有條帶出現(xiàn)且明顯清晰時拿出，水洗，然后浸入定影液中 10min 左右，待膠片變得透明，水洗，晾干。32 / 32第 3 節(jié) Flow cytometry 實驗操作棄掉各培養(yǎng)瓶或板中細胞上清液貼壁細胞可用預熱的 PBS 洗滌 1 次胰酶消化，棄去胰酶（原代細胞的胰酶盡量少些，不用棄去胰酶）加入含 1%FBS and %NaN3 的 PBS 洗液，輕輕吹打下細胞轉(zhuǎn)入 離心管中（ 6 孔板一個孔長滿的細胞量）1000 rpm, 4℃離心 5 min 收集細胞用 PBS 調(diào)整細胞懸液（ 1?106 個） （因后續(xù)有多次洗滌可能損失細胞，故此步可省去）棄上清后，再用 PBS 洗液洗滌兩次（棄上清時，不用槍吸，直接傾倒）每管加入 55 ?l PBS 洗液重懸細胞再加入 5 ?l Mouse AntiHuman CD54/FITC 標記抗體溶液，輕輕吹勻4℃避光孵育 30 min，離心去上清再用 PBS 洗液洗滌 2 次，去除多余抗體 ml %多聚甲醛固定, 4℃保存流式細胞儀測定，收集 10,000 個細胞（以上由方憲康、黃婭琳整理）以下均在 4℃ 進行