【正文】 ndIII單酶切 DNA ladder 。2. Ⅲand BamHI 4. 目的片段的回收 目的片段回收結(jié)果見圖34 ,結(jié)果顯示回收產(chǎn)物大小約為6Kb，與預(yù)期結(jié)果相符。1 2 36000bp圖34膠回收質(zhì)粒片段 1kb marker 質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ單酶切產(chǎn)物回收的雙切產(chǎn)物 Recovery products of linear plasmid1kb marker ⅢRecovery products of plasmid digested by double enzymes 重組載體的菌落PCR重組載體菌落 PCR電泳結(jié)果見圖35，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,電泳分析發(fā)現(xiàn)陽性產(chǎn)物可以擴(kuò)增出560bp大小的條帶，假陽性產(chǎn)物不能擴(kuò)增出560bp大小的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符，可以初步篩選出陽性產(chǎn)物。 1 2 3 4 5 6 7 8 9500bp600bppppppp圖35 重組質(zhì)粒菌落PCR電泳圖100bp marker；2均為單菌落PCR產(chǎn)物,其中2,5為陽性產(chǎn)物 bacterial colony PCR screening 重組質(zhì)粒大量提取重組質(zhì)粒大量提取后的電泳結(jié)果見圖36，與預(yù)期結(jié)果相符。1 2 3 4 5 66000 圖36 1kb DNA Marker； 23； 4；5Figure 36 rebined plasmid of 1kb DNA Marker； 23； 4；5重組質(zhì)粒大提并稀釋50倍以后在紫外分光光度儀Genespec上測其OD值，： 重組質(zhì)粒大提后OD值檢測結(jié)果Table the OD value result of rebination vectorOD260OD280RatioConc（μg/mL） 重組質(zhì)粒測序結(jié)果、38，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的堿基序列與預(yù)期結(jié)果一致，未發(fā)生堿基突變。圖37 Figure 37 Chomatography of the sequencing of rebined plasmid 圖38 Figure 38 Chomatography of the sequencing of rebined plasmid 討 論 菌落PCR鑒定重組采用菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒，可不必提取基因組DNA，不必酶切，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省時(shí)少力。 重組質(zhì)粒穿梭載體的構(gòu)建RNAi技術(shù)是一項(xiàng)快速、高效和便于操作的使靶向基因失活的新技術(shù)。，據(jù)此設(shè)計(jì)出的siRNA可以使某些特定的基因沉默[33]。這個(gè)載體的特點(diǎn)是含有H1啟動(dòng)子，在此H1啟動(dòng)子的作用是精確的起始和終止轉(zhuǎn)錄的過程。將具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的shRNA的cDNA序列插入其下游多克隆位點(diǎn)區(qū)，通過這樣的操作產(chǎn)生的RNA會(huì)折疊成shRNA，由于Dicer的作用，生成21bp的siRNA作為介質(zhì)促發(fā)RNAi作用。在參考了大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建、。并在此基礎(chǔ)上做了些調(diào)整：為了可以廣泛的篩選菌落，采用菌落PCR的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行初步篩選陽性菌落；利用含Amp抗生素的平板篩選陽性重組子，也起到了大大簡化篩選工作的功效[34]。結(jié) 論傳統(tǒng)的堿裂解法配合使用氯化鋰、PEG8000，可以快速、高效、優(yōu)質(zhì)的提取質(zhì)粒DNA。 采用雙酶切切割載體，可保證插入外源片段的方向，并且可以防止載體的自連，提高重組率。通過菌落PCR初步篩選陽性菌落，減少了繁瑣的質(zhì)粒提取過程及大量的酶切鑒定，大大提高了效率。利用含Amp抗生素的平板篩選陽性重組子，簡化了篩選工作。經(jīng)測序檢測結(jié)果可知成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體。齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)參考文獻(xiàn)[1] van der Krol AR，Mur LA，de Lange P，et a1．Inhibition of flower pigmentation by antisense CHS genes： promoter and imal sequence requirements for the antisense efect[J]．Plant Mol Biol，1990，14(4)：457—466.[2] Coqoni C, Morelli G, Carattoli A, Macino G. 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