【正文】 經(jīng)測(cè)序檢測(cè)結(jié)果可知成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體。6000bp kb marker ； 2. ； ；4. HindIII單酶切 DNA ladder 。（7）4℃離心10min（4000r/min）。（2）50℃水溶510分鐘，膠完全溶化即可，其間可振蕩助溶23次，待溶化后將溶液置于吸附柱中， 8000g/分 離心30s，若一次加不完，可分多次離心。l RNaseA，37℃，水浴30min。（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重懸細(xì)菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，溫和混勻，室溫放置10min，裂解大腸桿菌。(4)溶菌酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）： 10mmol/L TrisHCl（）。 本論文的主要內(nèi)容依據(jù)研究的目的及實(shí)驗(yàn)思路，本論文主要內(nèi)容包括1．根據(jù)腫瘤細(xì)胞的mrp1基因核苷酸序列，按照靶位點(diǎn)的尋找原則，設(shè)計(jì)并合成2個(gè)編碼shRNA的DNA模板shmrp11和shmrp12。RNAi的作為一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的技術(shù)手段，正逐步被應(yīng)用于遺傳性疾病、病毒性疾病以及腫瘤等的基因治療。 MRP的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用MRP1的底物 直接通過細(xì)胞毒性分析和底物刺激的ATP酶測(cè)量進(jìn)行識(shí)別MRP1的底物的，底物是由大量的多樣化的疏水復(fù)合物，有機(jī)陰離子結(jié)合物以及陰離子非結(jié)合性底物所組成。質(zhì)粒是為一種1200kb不等的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子。端突出的小分子RNA片斷，形成siRNA。這是RNAi的自身循環(huán)放大機(jī)制，其機(jī)制主要是指在效應(yīng)階段，RISC活化后與mRNA結(jié)合，mRNA被內(nèi)切核酸酶切割成大小在l2～23nt不等的小片段，這些片段可以特異性地阻礙表達(dá)靶基因。1994年，Cogoni[2]和Macino采用粗糙脈胞霉進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)真菌中也存在類似的現(xiàn)象，他們稱之為基因抑制，這一現(xiàn)象后來在其它真菌中也相繼被發(fā)現(xiàn)?；熥鳛槠涑Ｒ?guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。他們嘗試把pigmentproduing這種由強(qiáng)有力的啟動(dòng)子控制的基因?qū)氚珷颗；ㄒ约由罨ǖ淖仙?，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)不但顏色未加深，許多花呈現(xiàn)雜色甚至白色。[10] 特異性效應(yīng)轉(zhuǎn)錄后水平的RNA干擾的發(fā)生機(jī)制是在對(duì)果蠅、線蟲等生物體進(jìn)行科學(xué)研究從而進(jìn)一步推導(dǎo)得出來的。通過對(duì)植物的研究證明，雙鏈RNA復(fù)合體降解為35nt左右的小RNA分子后通過序列互補(bǔ)與mRNA結(jié)合，進(jìn)而降解mRNA。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。MRP1基因(ABCC1)。RNAi是一種用dsRNA作為序列特異性的觸發(fā)器指導(dǎo)同源單鏈RNA降解的細(xì)胞機(jī)制。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1的過度表達(dá)是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。 大提質(zhì)粒溶液配置(1)溶液I：50mmol/L C6H12O6，25mmol/L TrisHCl（），10mmol/L EDTA（）。（3）加預(yù)冷的溶液Ⅰ50ml于每離心桶，混勻，洗滌沉淀。（12）用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下以10000r/min離心5min，棄去乙醇，離心桶敞口倒置于紙巾上，使乙醇揮發(fā)殆盡。（3）Wash Solution：12ml，使用前加入48ml無水乙醇，充分混勻。（4）4℃離心10min（4000r/min）。、進(jìn)行質(zhì)粒大量提取,。 采用雙酶切切割載體，可保證插入外源片段的方向，并且可以防止載體的自連，提高重組率。5:389—406.[25] Hsia TC, Lin CC, Wang JJ et al. Relationship between chemotherapy response of small cell lung cancer and Pglycoprotein or multidrug resistancerelated protein expression. Lung 2002。 1 2 3 4 5 6 7 8 9500bp600bppppppp圖35 重組質(zhì)粒菌落PCR電泳圖100bp marker；2均為單菌落PCR產(chǎn)物,其中2,5為陽(yáng)性產(chǎn)物 bacterial colony PCR screening 重組質(zhì)粒大量提取重組質(zhì)粒大量提取后的電泳結(jié)果見圖36，與預(yù)期結(jié)果相符。[32] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞DH5α（1）從冰箱中取出一管（分裝6管，每管100μL）感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。（5）空吸附柱9000g/分再次離心1分鐘，甩干剩余液體以除去殘余酒精。（15）沉淀用3ml70%乙醇重懸清洗，以除去PEG，12000r/min離心8min。（6）加30ml預(yù)冷的溶液Ⅲ，緩慢顛倒數(shù)次，防止SDS破壞基因組DNA，冰浴放置15min，使蛋白質(zhì)沉淀出來。(7) TE（）緩沖液：1mol/L TrisHCl（）500μL， mol/L EDTA（）100μL，加水至50mL。4．載體與設(shè)計(jì)合成的干涉片段連接。隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于果蠅，線蟲，斑馬魚，真菌以及植物等生物體內(nèi)，這些生物體利用RNA干擾來抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。通過對(duì)基因敲除的動(dòng)物進(jìn)行研究確定了MRP1的功能。質(zhì)粒載體是為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工構(gòu)建的。目前, 影響siRNA功能的因素包括siRNA序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，靶mRNA的空間結(jié)構(gòu)RISC與siRNA的相互作用，以及siRNA與mRNA錯(cuò)配等[17]。抑制相應(yīng)mRNA的翻譯可阻礙相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)，這就是翻譯水平的RNA干擾機(jī)制[12]，其中stRNA起到了非常的重要作用。Fire[5]等將雙鏈 RNA，即正義鏈和反義鏈的混合物，注射到線蟲的體內(nèi)，卻誘發(fā)了比正義鏈或反義鏈的單獨(dú)注射效果更強(qiáng)的基因沉默，要徹底使同源基因的表達(dá)沉默，在每一個(gè)細(xì)胞中，只需要很少的幾個(gè)分子的雙鏈就可以做到。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達(dá)的技術(shù)，如能通過RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：RNA干擾；MRP1；；穿梭載體 AbstractCancer, a serious threat to human health, the incidence are on the rising trend. Chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, which is an irreplaceable way in cancer treatment. MDR of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . The reason causing the cancer MDR is relatively plicated, and the excessively expression of multidrug resistanceassociated protein 1(MRP1) is one of the reasons causing MDR. Silencing MDR1 gene by RNAi, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR.Objective: In this study, Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into Results: Constructing Key Words：RNA interference；MRP1；；shuttle vector目 錄摘 要 IAbstract II第1章 緒 論 1 RNAi的研究進(jìn)展 1 RNAi的發(fā)現(xiàn)過程 1 RNAi的分子作用機(jī)制 2 RNAi的特點(diǎn) 3 siRNA簡(jiǎn)介 3 siRNA的設(shè)計(jì)原則 3 RNAi在抗腫瘤方面的研究 4 用于RNAi的載體 4 5 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 5 MRP1的研究進(jìn)展 5 MRP的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用 6 MRP在組織中的表達(dá) 6 基因治療 7 本課題在國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀 7 本論文的研究目的及意義 8 本論文的主要內(nèi)容 8第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 9 實(shí)驗(yàn)材料 9 宿主菌 9 質(zhì)粒載體 9 載體通用引物 11 主要試劑及工具酶 11 主要儀器 12 實(shí)驗(yàn)方法 13 shRNA的設(shè)計(jì)與退火 13 合成干涉片段的退火 16 重組載體的構(gòu)建 17 20 測(cè)序鑒定重組載體 21 重組質(zhì)粒大提的OD值檢測(cè) 21第3章 結(jié)果與分析 22 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果 22 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后結(jié)果 22 目的片段的回收 23 重組載體的菌落PCR 24 重組質(zhì)粒大量提取 25 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果 26討 論 29 菌落PCR鑒定重組 29 重組質(zhì)粒穿梭載體的構(gòu)建 29結(jié) 論 30參考文獻(xiàn) 31致 謝 3431 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)第1章 緒 論 RNAi的研究進(jìn)展RNA干擾(RNA interference , RNAi)是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，為一種雙鏈RNA分子在mRNA 水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達(dá)的過程，是一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)。[9]。任何單個(gè)堿基的改變即導(dǎo)致RNAi失效，RNAi能特異性降解mRNA，針對(duì)同源基因共有序列的RNAi則可使同源基因全部失活。目前使用的已知載體除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母、細(xì)菌人工染色體載體以及動(dòng)、植物病毒載體等[19]作為基因工程中使用的載體必須具備以下條件：（1）有復(fù)制起點(diǎn)，在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；（2）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)；（3）具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記基因；（4）分子量小，拷貝數(shù)多；（5）具有較高的外源DNA的載裝能力；（6）安全，不含對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，不會(huì)任意轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞以外的其它生物細(xì)胞中。在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，同種質(zhì)粒的三種構(gòu)型遷移速率各不相同，超螺旋構(gòu)型的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA走得最快，其次是線狀DNA，最慢的是開環(huán)DNA。 基因治療基因治療是腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的手段之一，所謂基因治療是指利用遺傳或分子生物學(xué)方法將外源基因?qū)松矬w內(nèi)或人體細(xì)胞內(nèi)，以彌補(bǔ)所缺失的基因或關(guān)閉、降低異常基因的表達(dá)，從而對(duì)疾病進(jìn)行治療。 本論文的研究目的及意義癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。10TBE電泳緩沖液：Tris堿54g，EDTA（5M，）20ml，ddH2O定容至500ml。預(yù)冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。再次沉淀核酸。 反應(yīng)體系如下：（） 2μLHindⅢ （10U/μL）1μLBamHI （10U/μL）1μL 10buffer tangoTM with BSA 2μLdd H2O 14μL反應(yīng)條件：37℃ 3h, 80℃ 20min 。（2） 菌液轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)23h。PCR反應(yīng)條件為：模 板單菌落10buffer without MgCl2 μLMgCl2 （25 mmol/L） μLdNTP （） μL正向引物（載體通用引物）1μL反向引物（載體通用引物）1μLTaq酶（2U/μL） μLddH2O μL94℃預(yù)變性2分鐘；94℃ 變性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸1分鐘，4℃保存，％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。在參考了大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建、。我深深地感受到這個(gè)大家庭帶給我的溫暖。 重組質(zhì)粒穿梭載體的構(gòu)建RNAi技術(shù)是一項(xiàng)快速、高效和便于操作的使靶向基因失活的新技術(shù)。 （4）向各管中加入1mL LB液體培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1h，保證恢復(fù)細(xì)菌正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Amp）。（8）9000g/分離心1分鐘，管底溶液即為雙酶切后質(zhì)粒載體。（17）小心吸上清與另一離心管中，加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，（3mol ，）以除去酚，冰上沉淀20min，4℃下10000r/min離心15min，使DNA沉淀