【正文】 具有以下的功能：（1）運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；（3）為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。目前使用的已知載體除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母、細(xì)菌人工染色體載體以及動(dòng)、植物病毒載體等[19]作為基因工程中使用的載體必須具備以下條件：（1）有復(fù)制起點(diǎn)，在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；（2）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)；（3）具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記基因；（4）分子量小，拷貝數(shù)多；（5）具有較高的外源DNA的載裝能力；（6）安全，不含對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，不會(huì)任意轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞以外的其它生物細(xì)胞中。載體按其應(yīng)用范圍，可以分為克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體是指用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。表達(dá)載體是指使目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)的載體。可將重組體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。質(zhì)粒是為一種1200kb不等的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子。是染色體外穩(wěn)定遺傳，并能以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中的因子。RNA干擾實(shí)驗(yàn)通常選用質(zhì)粒作為載體。質(zhì)粒載體是為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工構(gòu)建的。構(gòu)建的質(zhì)粒載體與天然質(zhì)粒相比通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)，同時(shí)可能帶有多個(gè)人工合成的單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。但是，天然質(zhì)粒的缺點(diǎn)是分子量大，拷貝數(shù)低，所以為使分子量盡可能減少，必須去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。[20]除此之外，質(zhì)粒載體一般還帶有一些可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄外源DNA、鑒定片段的插入方向等用途的序列。[21]細(xì)菌質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體的自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，只有酵母的殺傷質(zhì)粒已知是RNA分子。環(huán)狀雙鏈DNA分子有三種構(gòu)型。包括兩條鏈的環(huán)狀結(jié)構(gòu)都保持完整的呈超螺旋構(gòu)型的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，雙鏈中有一條鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)完整，只在另一條單鏈上有切口的開環(huán)DNA（ocDNA)以及雙鏈斷裂呈線狀的線狀DNA[22]。在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，同種質(zhì)粒的三種構(gòu)型遷移速率各不相同，超螺旋構(gòu)型的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA走得最快，其次是線狀DNA，最慢的是開環(huán)DNA。 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇（2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組（3）縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量（4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 MRP1的研究進(jìn)展在1992年多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1又被稱為ABCC1）的識(shí)別以及它的起始特征闡明了這種蛋白確實(shí)代表了一種選擇性藥物泵。編碼MRP1的cDNA第一次克隆是通過從阿霉素選擇性的多藥耐藥人腫瘤細(xì)胞系（H69R）中篩選差異cDNA得到的。MRP1基因(ABCC1)。經(jīng)序列分析，將MRP1分為ATP結(jié)合框超家族中的一員，MDR/P糖蛋白也屬于這一超家族。MRP1是一個(gè)膜整合糖磷蛋白，其表觀分子量為190kDa[23,24]，一個(gè)運(yùn)用ATP結(jié)合/水解[25,26]產(chǎn)生的能量，來行使此蛋白主要的有活性的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。 MRP的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用MRP1的底物 直接通過細(xì)胞毒性分析和底物刺激的ATP酶測(cè)量進(jìn)行識(shí)別MRP1的底物的，底物是由大量的多樣化的疏水復(fù)合物，有機(jī)陰離子結(jié)合物以及陰離子非結(jié)合性底物所組成。典型的結(jié)合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物，MRP1的組織分布 MRP1在體內(nèi)的表達(dá)可以說是無所不在。MRP1表達(dá)水平最高的組織包括：肺，睪丸，腎，心和胎盤；MRP1的生理作用 MRP1在作為機(jī)體主要防線的組織中分布，以及MRP1的底物特異性，表明MRP1有保護(hù)機(jī)體免受外源生物質(zhì)和內(nèi)源毒性代謝物侵害的生理作用。通過對(duì)基因敲除的動(dòng)物進(jìn)行研究確定了MRP1的功能。盡管很多體外實(shí)驗(yàn)明確的證實(shí)了：MRP1介導(dǎo)外源和內(nèi)源物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。但是幾次嘗試證實(shí)MRP1在體內(nèi)的保護(hù)作用都沒有成功。 MRP在組織中的表達(dá)典型的MDR機(jī)制在腫瘤耐藥中起一定作用，但多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)MDR1基因和PgP在腫瘤中的表達(dá)水平并不高，難以解釋NSCIC的高度耐藥。Narasaki等發(fā)現(xiàn)許多癌組織同時(shí)表達(dá)MRP1和MDR1，但后者表達(dá)較低，故認(rèn)為MRP 1較MDR1能是反映腫瘤多藥耐藥更好的指標(biāo)。在腫瘤復(fù)雜的耐藥機(jī)制中，MRP1和MRP3的過度表達(dá)發(fā)揮了重要作用。Oguri等報(bào)道在運(yùn)用鉑類化療藥物后，40例腫瘤患者的MRP5表達(dá)較用藥前明顯增高，且伴有MRP1及GSH的升高，故認(rèn)為MRP5可能與GSH 一起參與MRP1導(dǎo)的多藥耐藥[27]。 基因治療基因治療是腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的手段之一，所謂基因治療是指利用遺傳或分子生物學(xué)方法將外源基因?qū)松矬w內(nèi)或人體細(xì)胞內(nèi)，以彌補(bǔ)所缺失的基因或關(guān)閉、降低異?；虻谋磉_(dá)，從而對(duì)疾病進(jìn)行治療?；蛑委熓侵委熌[瘤的新手段，目前共有3種MDR基因治療的策略：將相關(guān)凋亡基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，促使其凋亡；使用反義技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞耐藥基因表達(dá)；將外源mdr1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入人造血干細(xì)胞以提高骨髓對(duì)化療藥物的耐藥性。 本課題在國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀多藥耐藥蛋白基因1編碼的多藥耐藥蛋白的過度表達(dá)是重要的腫瘤耐藥機(jī)制之一。RNAi是一種用dsRNA作為序列特異性的觸發(fā)器指導(dǎo)同源單鏈RNA降解的細(xì)胞機(jī)制。在最近的研究中顯示特定目的基因的表達(dá)可被RNA干擾高效抑制。小干擾RNA(siRNA)作為一種中間介質(zhì)，介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與之同源基因的沉默 [28]。RNAi的作為一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的技術(shù)手段，正逐步被應(yīng)用于遺傳性疾病、病毒性疾病以及腫瘤等的基因治療。從1990年，植物學(xué)家對(duì)矮牽?；ㄗ⑷爰t色素基因，卻使花變成白色，到1995年Su Guo博士利用線蟲完成的實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)了RNA干擾的現(xiàn)象，但是并未能對(duì)其理論做出合理解釋。直到1998年，Andrew Fire等證實(shí)Guo等發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量dsRNA而引發(fā)，Andrew Fire和Craig Mello將這一現(xiàn)象命名為RNAi，并于1998年在Nature上發(fā)表了相關(guān)論文。隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于果蠅，線蟲，斑馬魚，真菌以及植物等生物體內(nèi)，這些生物體利用RNA干擾來抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。近幾年來RNAi的研究取得了很大進(jìn)展,2001年它被《Science》雜志評(píng)為十大科學(xué)成就之一,2002年被評(píng)為十大科學(xué)成就之首。[29]自2002年5月以后，先后出現(xiàn)將RNAi技術(shù)應(yīng)用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美國(guó)科學(xué)家Mc Caffrey）和癌細(xì)胞（如我國(guó)徐根興教授）的研究報(bào)道。這一發(fā)現(xiàn)提示可以應(yīng)用RNAi技術(shù)來抑制MRP1基因的蛋白表達(dá)。Nieth C等（2003）發(fā)現(xiàn)臨床上化學(xué)合成siRNA更適于聯(lián)合治療，可以利用化學(xué)合成的siRNA同時(shí)轉(zhuǎn)錄多種MRP相關(guān)基因，如其他ABC轉(zhuǎn)運(yùn)編碼基因或細(xì)胞凋亡編碼基因等，而且也可同時(shí)編碼其他致癌基因或血管生成因子進(jìn)行聯(lián)合治療2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予兩名美國(guó)科學(xué)家，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。由于RNAi技術(shù)的高效性和高度特異性，RNAi已成為頗為理想的細(xì)胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究中不可或缺的重要手段，并為基因治療開辟了新的途徑?，F(xiàn)RNAi已廣泛應(yīng)用到HIV、病毒性肝炎、基因治療及藥物篩選探索中，對(duì)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性干擾作用的研究也正在迅速發(fā)展中，隨著研究的深入和發(fā)展，將為MRP細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)提供一個(gè)安全有效的途徑。 本論文的研究目的及意義癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?；熥鳛槠涑Ｒ?guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1的過度表達(dá)是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。RNA干擾是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達(dá)的技術(shù)，如能通過RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)mrp1基因設(shè)計(jì)并合成了兩對(duì)能編碼siRNA的DNA片段，為研究以RNAi技術(shù)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本論文的主要內(nèi)容依據(jù)研究的目的及實(shí)驗(yàn)思路，本論文主要內(nèi)容包括1．根據(jù)腫瘤細(xì)胞的mrp1基因核苷酸序列，按照靶位點(diǎn)的尋找原則，設(shè)計(jì)并合成2個(gè)編碼shRNA的DNA模板shmrp11和shmrp12。2．。3．質(zhì)粒載體經(jīng)Hind Ⅲ和BamH I雙酶切，并進(jìn)行膠回收。4．載體與設(shè)計(jì)合成的干涉片段連接。5．，檢測(cè)重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確；重組質(zhì)粒大量提取，進(jìn)行OD值檢測(cè)。第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料 宿主菌 DH5α：為感受態(tài)宿主菌由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。 質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒源自Genscript公司（Scotch PlamsUSA）。： ，shRNA的表達(dá)由人的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子H1 Promoter啟動(dòng)，H1啟動(dòng)子屬于PolⅢ啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子總在其下游的固定距離開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，轉(zhuǎn)錄過程遇到4~5個(gè)連續(xù)的U即終止，非常精確；同時(shí)CMV Promoter為真核生物啟動(dòng)子，可在該質(zhì)粒中高效啟動(dòng)紅色熒光蛋白（Red Fluorescence Protein，RFP）的表達(dá)；MCS為多克隆位點(diǎn)。質(zhì)粒圖譜見圖21圖21 Detailed map of 載體通用引物正向引物（M13）：5′GTTTTCCCAGTCACGAC3′反向引物（Rev）：5′ GAGTTAGCTCACTCATTAGGC 3′ 主要試劑及工具酶質(zhì)粒快速提取試劑盒上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司10PCR buffer北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司dNTP上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司Marker(1kb,100bp)上海生工生物工程技服務(wù)有限公司Goldview DNA染料北京賽百盛基因技術(shù)有限公司吖啶橙北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司氨芐青霉素上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司EDTABio Basic Inc溶菌酶北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司LiClAmrescoRNaseSigmabactotyptoneBio Basic Incbactoyeast extractBio Basic IncPEG8000北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司TriS飽和酚北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司HindⅢNEB公司BamHINEB公司T4DNA連接酶NEB公司Taq酶北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司 電泳緩沖液及培養(yǎng)基 50TAE電泳緩沖液：Tris堿242g，EDTA（Na2EDTA2H2O），定容至1000mL。10TBE電泳緩沖液：Tris堿54g，EDTA（5M，）20ml，ddH2O定容至500ml。LB液體培養(yǎng)基：將bactotyptone 2g、bactoyeast extract 1g和NaCl 2g，溶于195mL雙蒸H2O，定容至200ml，共配置5份，121℃濕熱滅菌30min。固體選擇培養(yǎng)基（Ampr）：每100ml ，121℃濕熱滅菌20min，待溫度降至60℃加入終濃度為50μg/mL的氨芐青霉素，混勻后倒平板，4℃保存?zhèn)溆谩?大提質(zhì)粒溶液配置(1)溶液I：50mmol/L C6H12O6，25mmol/L TrisHCl（），10mmol/L EDTA（）。(2)溶液II：，1% SDS。(3)溶液III：5mol/L KAc600mL， 冰乙酸115mL，H2O 285mL。(4)溶菌酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）： 10mmol/L TrisHCl（）。(5) PEG8000緩沖液： PEG8000溶于50mL 。(6) 70%乙醇：取300mL無水乙醇溶于700mL水中。(7) TE（）緩沖液：1mol/L TrisHCl（）500μL， mol/L EDTA（）100μL，加水至50mL。 主要儀器微量振蕩器（MM2型）上海像華化工有限公司微量振蕩器（MM2型）上海像華化工有限公司恒溫空氣搖床北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司電子天平北京賽多利斯天平有限公司紫外分析儀（ZF型）上?？等A生化儀器制造廠低溫離心機(jī)（SK18）SIGMA公司低溫離心機(jī)（SK18）SIGMA公司PCR儀（9600型）