最新引物設(shè)計(jì)原則必看-資料下載頁
2025-06-30 02:43本頁面
【正文】 mer。引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2（G C） （A T ，Ln值不能大于38，因?yàn)?8時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。 C含量 G C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G C） 2（A T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。 兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 ′端 引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（ASPCR）反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。 在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV1 gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的。 ′端 引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3 等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。 特殊目的的引物設(shè)計(jì)將在有關(guān)章節(jié)討論。隨著人們對(duì)引物的認(rèn)識(shí)，一些引物的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)程序也應(yīng)運(yùn)而生，下面將討論有關(guān)引物計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法。
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