【正文】 光度[34]。 結(jié)果與討論 牛血清蛋白標準曲線的繪制圖32 牛血清蛋白標準曲線 Fig 32 The standard curve of bovine serum albumin 由圖可知。 單因素實驗（加水倍數(shù)）圖33 加水倍數(shù)對吸光度的影響 Fig 33 The effort of watering multiple on Absorbance 單因素實驗（浸潤時間）圖34 浸潤時間對吸光度的影響Fig 33 The effort of Infiltration on Absorbance 單因素實驗（煎煮時間）圖35 煎煮時間對吸光度的影響Fig 33 The effort of Decocting Time on Absorbance 正交試驗設計表32 因素水平表Tab 32 Orthogonal Optimum Design 水平 因素水的用量A （倍） 浸潤時間B (min) 煎煮時間C (min)1 10 10 302 14 15 453 18 20 60 正交實驗結(jié)果表33 水煎法提全蝎蛋白含量及直觀分析Tab 33 Orthogonal Optimum Design試驗號水的用量A（倍）浸潤時間B（min）煎煮時間C（min）空列 吸光度D蝎毒蛋白含量（g）11111 2122 2 3133 3 4213 2 5221 3 6232 1 7312 3 8323 1 9331 2 K1 T=Y= K2 K3 R 實驗結(jié)果分析以蝎毒蛋白含量為考察指標，由表38中極差R值大小顯示各因素作用的主次為CAB，A因素以2水平為佳，B因素以2水平為佳，C因素以3水平為佳。由極差分析可知，用14倍量水浸潤15分鐘，隔水煮沸60 min，所得的蛋白含量最高。至于所提得的蝎毒蛋白生物活性如何，有待于進一步用藥效學方法進行評價。4 活蝎蝎體蛋白的分離純化 實驗材料 原材料沂蒙全蝎，屬東亞鉗蝎。平均體長（伸展長度） cm，2008年7月初采集于山東省淄博市沂源縣南麻鎮(zhèn)北部歷山、馬頭崮。 實驗試劑1. 葡聚糖凝膠Sephadex G75填料2. 硫酸銨固體 3. 緩沖液的配制：在1000 g的NaH2PO4H2O。 4. 考馬斯亮藍G250染色液的配置：稱取100 mg考馬斯亮藍G250溶于50 ml95%乙醇中。加入100 ml85%磷酸，將溶液用水稀釋到劑的終含量為：%考馬斯亮藍G250，%乙醇，%磷酸。5. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑配制 Ⅰ A液：丙烯酰胺儲存液，100 ml，30% (w/v) 丙烯酰胺，% (w/v) 雙丙烯酰胺， g 丙烯酰胺， g 雙丙烯酰胺。Ⅱ B 液：4分離膠緩沖液，100 ml (可在 4℃ 存放數(shù)月)75 ml 2 mol/L TrisHCl (pH ) mol/L4 ml 10% SDS % 21 ml 蒸餾水 Ⅲ C 液：4堆積膠緩沖液，100 ml (可在4 ℃存放數(shù)月) 50 ml 1M TrisHCl (pH ) mol/L 4 ml 10% SDS % 46 ml 蒸餾水 Ⅳ 10% 過硫酸銨，5 ml(可在4℃存放數(shù)月) g 過硫酸銨；5 ml 蒸餾水Ⅴ 電泳緩沖液，1 L (可在室溫下長期保存) 3 g Tris堿 25 mM g 甘氨酸 192 mM 1 g SDS % 加蒸餾水至1 LⅥ 5 樣品緩沖液，10 mL (可在 4℃存放數(shù)周，或在20℃保存數(shù)月) ml 1 M TrisHCl (pH ) 60 mmol/L 5 ml 50%的甘油 25% 2 ml 10%的SDS 2% ml 2巰基乙醇 mmol/L 1 ml 1%溴酚藍 % ml 蒸餾水6. 藍色葡聚糖2000 分子量大于200萬7. N乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液（以洗脫液飽和）8. 牛血清蛋白 分子量664099．胰凝乳蛋白酶 分子量2570010. 電泳所用標準蛋白（表4—1）表4—1 markerTab 41 marker蛋白種類來 源MW（Da）磷酸酶b 兔子肌肉 97,200 牛血清蛋白 牛 66,409卵清蛋白 雞蛋白 44,287 碳酸苷酶 牛 29,000胰蛋白酶抑制劑 大豆 20,100 溶菌酶 雞蛋白 14,300 實驗儀器 1. DS1高速組織粉碎機 上海標本模型廠 2. FC204精密電子天平 上海安亭科學儀器廠 3. HH2恒溫水浴鍋 金壇市科興儀器廠 4. 飛鴿Anke LxJIIB離心機 上海安亭科學儀器廠5. TGL16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠6. 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE5C2S 上海亞榮生化儀器廠7. SHBIII 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司 8. 791磁力攪拌器 龍口先科儀器公司9. ULTRA TURRAX T18 basic勻漿機 IKA 10. 紫外分光光度計 NEWLUBO 2200 Pro11. 50 cm層析柱 上海錦華層析設備廠12. BS100 A自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠13. 蠕動泵14. 透析袋15. 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一16．垂直板電泳槽 北京六一 實驗方法 活蝎蝎體蛋白的提取 g新鮮活蝎加入高速組織粉碎機進行處理約5分鐘，轉(zhuǎn)移至研缽研磨約四十分鐘，將渾濁液再轉(zhuǎn)移至燒杯，加入100 ml磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉緩沖液，將混合液置于勻漿機下勻漿10 min，待溶液靜置分層，取出上層淡黃色提取液，經(jīng)在410℃條件下8000 rmin離心10 min取上清液進行抽濾，得淡黃色透明液體。按比例在總蛋白溶液中加入硫酸銨鹽析進行蛋白質(zhì)純化實驗，其飽和濃度應達到90％。4℃條件下48 h靜置后，得到淡黃色絮狀沉淀。4l0攝氏度條件下5000 rmin離心15 min收集蛋白沉淀物，用一定比例的蒸餾水溶解蛋白沉淀物，在18℃條件下溫和攪拌3 h促溶，待蛋白質(zhì)溶解完全后離心，收集上蛋白清液。將剩余沉淀物加入蒸餾水繼續(xù)溶解，攪拌促溶、離心，收集上層蛋白溶液，棄去雜質(zhì)沉淀。合并上清蛋白溶液，4℃下透析除鹽，3 d后經(jīng)鋇鹽檢驗證實透析完全。充分濃縮透析后的蛋白溶液， g蝎體水溶性總蛋白質(zhì)粉末。暫時置于冰箱保存。 炮制全蝎蝎體蛋白的提取另取同等質(zhì)量的、經(jīng)最優(yōu)炮制條件炮制的藥用全蝎粉末，轉(zhuǎn)移至研缽研磨四十分鐘，提取方法與新鮮活蝎的大致相同，提取的蛋白液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀充分濃縮， g蛋白質(zhì)粉末。暫時置于冰箱保存。 裝柱將凝膠在沸水中水浴2個小時，使之充分溶脹，將凝膠顆粒沉降，漂去懸浮顆粒，加一定量緩沖液，輕輕攪拌，除去細小碎片，到表面沒有顆粒時，就可以裝柱。將層析柱中加入緩沖液，出口端有緩沖液時，關閉出口，沿玻璃棒倒入四分之三柱高，再小心向柱上方加入1 cm高緩沖液，旋緊接頭，啟動蠕動泵，調(diào)整流速3 ml/10 min，用2倍柱床體積緩沖液清洗柱子[35]。 測標準蛋白分子量標準曲線 mg藍色葡聚糖2000（分子量200萬以上）2份，分別放在稱量瓶中，再稱取標準蛋白牛血清白蛋白（分子量66200），胰凝乳蛋白酶（分子量25700） mg，分別放在各稱量瓶中；各瓶加入N— ml，使混合物溶解后分別上柱。用緩沖液洗脫，流速3 ml/10 min，每3ml收集一管。洗脫組分用考馬斯亮藍染色法在595 nm可見光下測吸光度，由于蛋白質(zhì)吸光度與其濃度成正比，故可繪吸光度曲線來測出洗脫峰，得出標準蛋白洗脫體積Ve及外水體積V0。以Ve/V0為縱坐標，logMW為橫坐標得出一條標準曲線。 活蝎蝎體蛋白的凝膠層析配制活蝎蝎體蛋白液， mg/ml， ml上樣，上樣條件和洗脫條件于上述方法相同，所得的各組分用考馬斯亮藍染色法測吸光度，按檢測峰不同部分收集各組分并計算分子量。 炮制全蝎蝎體蛋白的凝膠層析配制炮制過全蝎蝎體蛋白液， mg/ml， ml上樣，上樣條件和洗脫條件于上述方法相同，所得的各組分用考馬斯亮藍染色法測吸光度，按檢測峰不同部分收集各組分并計算分子量。 SDSPAGE電泳驗證電泳方法采用不連續(xù)膠系統(tǒng)，5％％分離膠，考馬斯亮藍法染色，標準分子量蛋白為兔磷酸化酶B( kD)，牛血清白蛋白( kD)，兔肌動蛋白( kD)，牛碳酸酐酶(29 kD)，胰蛋白酶抑制劑( kD)，雞蛋清溶菌酶( kD)。以分別檢測活蝎蝎體和炮制全蝎蝎體各蛋白質(zhì)組分、蛋白質(zhì)分子量的分布情況[36]。 結(jié)果與討論 分子量標準曲線的測定 凝膠參數(shù)測定1. 柱床體積Vt：Vt=(D／2)2h=(／2)250= ml；2. 外水體積V0：用藍色葡聚糖2000過濾， ml； 標準蛋白分子量曲線方程經(jīng)考馬斯亮藍染色法檢測標準蛋白的洗脫組分，結(jié)果為牛血清蛋白在第14管出峰， ml；胰凝乳蛋白酶在第25管出峰， ml。，根據(jù)以上數(shù)據(jù)組圖如圖41所示。圖41標準蛋白分子量曲線方程Fig 42 Curve equation of standard protein Molecular Weight可知標準蛋白分子量曲線方程為：Ve／V0=－logMW＋ 活蝎蝎體蛋白的凝膠層析結(jié)果及分析 圖42 活蝎蝎體蛋白組分的分離 Fig 42 Isolation of fraction from living scorpion by Sephdex G75 從凝膠層析的結(jié)果（圖42）可以看出，活蝎蝎體蛋白大約有7個組分，將每個組分的吸光度的峰所對應的洗脫體積代入標準蛋白分子量曲線方程Ve／V0=－logMW＋，計算其分子量分別約為68000、46000、28000、24000、19000、8000、5000左右，周新華等[12]從東亞鉗蝎蝎尾毒中分離出18個蛋白組分，分子量從300010000不等，其中11個具有藥理學毒性，分子量全部集中在72009800之間，根據(jù)此可以猜測所得到的大分子蛋白基本來自蝎尾毒之外的蝎身蛋白。 炮制全蝎蝎體蛋白的凝膠層析結(jié)果及分析圖43 炮制全蝎蝎體蛋白組分的分離Fig 43 Isolation of fraction from scorpion in medication by Sephdex G75如圖43所示，經(jīng)炮制的全蝎蝎體蛋白組分與新鮮活蝎蛋白組分大體相同，將各組分峰值對應的洗脫體積代入標準蛋白分子量曲線方程Ve／V0=－logMW＋，所得分子量大體相等。不同點在于炮制的全蝎蝎體蛋白在分子量為46000和8000左右處分別少了一個峰，這說明在煎煮過程中某些蛋白質(zhì)組分遭到了破壞。 凝膠電泳結(jié)果及分析圖44 電泳結(jié)果Fig 44 The result of SDSPAGE左一：炮制全蝎蝎體蛋白左二：活蝎蝎體蛋白經(jīng)SDSPAGE（圖44）驗證可知，由凝膠層析所計算出的各組分分子量范圍與電泳所得結(jié)果大致吻合。但由于樣品未經(jīng)稀釋濃度較大，有些蛋白組分可能未能充分跑開，所得結(jié)果不是十分理想，這一點在圖中也有所體現(xiàn)。 對實驗結(jié)果的幾