【正文】 72℃補充延伸2min4℃保存forever tyrA、tnaB、talB、aroF 、lpl、gabD、gabT的菌落PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。反應(yīng)體系：Taq聚合酶反應(yīng)體系10ul體系2easy taq mix5ulPrimer_upPrimer_downDNAtemplate 200ngddH2O4ul反應(yīng)條件：、 同源重組成功的單克隆的獲取（1）將競爭PCR驗證正確的單菌落加入至5ml k+s抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；（2）從過夜培養(yǎng)的菌液中挑菌在k+s的LB平板上劃線；（3）挑取單菌落進行PCRtnaB、talB、tyrA、lplA、aroF反應(yīng)體系Takara primer star HS（roloA）Component 50ul5*primer star buffer 10uldNTP mixture ( each) 4ulprimer1（10uM） 1ul (10pmol)primer2（10uM） 1ul（10pmol）重組BL21 genomic 2ulprimer star ploymecase ddH2O 33ultnaB、talB、tyrA、lplA、aroF反應(yīng)條件98℃預(yù)變性DNA30s98℃變性10s℃退火5s72℃延伸2：30s34個循環(huán)后72℃補充延伸2min12℃保存forevergabD、gabT反應(yīng)體系Q5反應(yīng)體系 25ul體系5*Q5 reaction buffer 5ul10mM dNTP 10uM Fprimer 10uM Rprimer DNA Template genomic 1ng~1ugQ5 DNA polymerase 5*High GC enhancor 4ulddH2O gabD、gabT反應(yīng)條件將PCR產(chǎn)物送至博尚生物測序。 Ptarget和cas9質(zhì)粒的去除a. 陽性克隆子接LB液體（kan抗性），劃線分單菌，并驗證質(zhì)粒pTarget 的消除。b. 質(zhì)粒B消除的陽性菌重新進行下輪的基因替換操作。c. 37度液體培養(yǎng)，消除質(zhì)粒pCasd. 將消除兩個質(zhì)粒的但菌落，劃線擴增。e. 將每個擴增后的但菌落分別接種到kana板30℃培養(yǎng)和spe板37℃培養(yǎng)，進行驗證。3 結(jié)果與分析由于本身細菌體內(nèi)的新陳代謝的復(fù)雜性，故在k+s板上生長的細菌未必是同源重組成功地細菌，故在進行后續(xù)實驗之前，應(yīng)當先進行競爭圖41競爭PCR條件優(yōu)化1：mutalB 2：1kb plus maker 3：wttalB 4：muaroF 5：wtaroF 6：mutnaB 7：wttnaB 8：mutyrA 9：wttyrA 10：mugabD 11:wtgabD 12：mugabT 13：wtgabT 14：mulplA 15：wtlplA 圖42 競爭PCR結(jié)果對比1：muaroF 2：control 3：1 kb plus maker 4：mutnaB 5：controltnaB 6：mugabD 7：controlgabD 8：muttalB 9：muttyrA 10：mutgabT 11：mutgabD 12：1kb plus 13：controltalB 14：controltyrA 15：controlgabT 16：controlgabDPCR優(yōu)化找出重組型適合的PCR退火溫度而野生型不適合的退火溫度，在根據(jù)這一特點來對未知的重組菌進行驗證。圖41，圖424．討論圖43 cas9基因工作流程向重組細胞中導(dǎo)入的cas9質(zhì)粒上包括三種基因，第一種是red重組所需要的gam，exo，bet基因這些基因?qū)⒄T導(dǎo)線性片段與重組菌染色體之間的同源重組，第二種基因它可以在IPTG的誘導(dǎo)下將Ptarget質(zhì)粒去除，從而完成Ptarget質(zhì)粒的去除。第三種是用來將基因組染色體切斷的cas9蛋白合成基因。還有最后自身的標記基因，用于自身的篩選。將其和Ptarget質(zhì)粒導(dǎo)入細胞中，B8菌本身的染色體將會被切割，細胞將會死亡，但是cas9質(zhì)粒上red重組基因?qū)⒄T導(dǎo)線性片段與細胞染色體基因之間的同源重組，將被破壞的片段修補，從而完成重組菌的篩選工作。北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 第五章 回補基因?qū)ι彼岙a(chǎn)量的定量分析第五章 回補基因?qū)w生長和色氨酸生產(chǎn)的影響1 材料表11 菌株和質(zhì)粒Table 11 Strains and plamids菌株和質(zhì)粒Strains and plamids基因型或表現(xiàn)型Genotype or phenotype來源或文獻Source of referenceStrains：E．coil DH5αWtBL21HoloBL21Plamids：RBS8Cloning of bacteriaBiomedThis labThis labThis lab M9YE培養(yǎng)基Na2HPO412H2O KH2PO4 3g/lNaCl NH4Cl 1g/l(1%)MgSO4 1mlCaCl2 1mlGlycose 10g/lYE 1g/l紫外分光光度計 島津液相色譜儀2 方法 RBS8質(zhì)粒的擴增（1） 將RBS8質(zhì)粒導(dǎo)入到擴增菌DH5α中，將活化完成后的DH5α涂板在Cm抗性的LB平板上。（2） 從Cm抗性的LB板上挑出單菌落，接種至含有Cm抗性的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。（3） 從過夜的菌液中提取RBS8質(zhì)粒。 mutB8/mutRBS8中mutRBS8質(zhì)粒的剔除（1）將mutB8/mutRBS8的包藏菌種接種至含有Cm抗性的LB板進行復(fù)蘇。（2）從LB板上挑菌加入到含有Cm抗性的5ml液體LB培養(yǎng)基當中（3）從LB液體培養(yǎng)基中取出100ul菌液加入到10ml的M9YE培養(yǎng)基中（4）完成傳代培養(yǎng)8次，在無抗LB平板劃線（5）挑取10個單菌落，在LB板上劃線，而后在Cm板上驗證 BL2mutBwtB holoB8感受態(tài)的制備 RBS8質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化（1）將一株單菌落加入至M9YE培養(yǎng)基中37℃，200rpm培養(yǎng)24h左右，使其菌體濃度達到OD600=4（2）將菌體稀釋至OD600=~1后紫外分光光度計測定它的濃度。（3）用M9YE培養(yǎng)基按梯度對菌液進行稀釋后用酶標儀測定，每組做3個平行 wtBLholoBL8和BL21 生長曲線的對比（1）將電轉(zhuǎn)和化學(xué)轉(zhuǎn)化成功的單菌落劃線擴增（2）從擴增板挑取少量工程菌接入10ml1‰氯霉素抗性的LB種子培養(yǎng)基中37℃，200rpm培養(yǎng)16h。（3）從種子培養(yǎng)基中取100ul加到10ml加有2‰IPTG（24mg/L）和1‰(34mg/L)氯霉素抗性的M9YE培養(yǎng)基中，將其分裝至酶標板中每組10個平行用酶標儀37℃發(fā)酵24h每過10min測定一次OD。 色氨酸含量的測定（1）從種子培養(yǎng)基中去200ul種子液加到20ml含有2‰（24mg/L）IPTG和1‰（34mg/L）的氯霉素的M9YE培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵24h。（2）從發(fā)酵產(chǎn)物中取1ml發(fā)酵液，常溫13000轉(zhuǎn)離心10min將上清加入樣品瓶中，用液相色譜測定，液相參數(shù)為流動相A H3PO4 % 流動相B 甲醇100% 泵B 2% 。（3）按照色氨酸的標準曲線y=x/35593171得到色氨酸產(chǎn)量3 結(jié)果分析圖51 酶標測定值與OD600之間的校正曲線圖52 菌體生長曲線對比圖圖53 菌體的生長曲線通過生長曲線的測定得出重組的talB、lplA、tnaB、aroF、gabD、gabT、tyrA對菌種的整體代謝沒有太大的影響，另外Bl21的菌體生長快于其他各個菌株表明色氨酸的合成影響的菌體的生長。圖54 色氨酸產(chǎn)量根據(jù)色氨酸產(chǎn)量的對比圖發(fā)現(xiàn)wtB8和mutB8以及holoB8的色氨酸含量并沒有太大的詫異，說明造成色氨酸產(chǎn)量變化的原因并不是由于基因組的影響，而是由于質(zhì)粒上的突變所造成。北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 參考文獻4討論圖53 色氨酸生物代謝圖色氨酸高產(chǎn)菌B8成功培育出之后，本實驗室通過artp誘導(dǎo)使的色氨酸內(nèi)部的質(zhì)?；蛞约叭旧w基因發(fā)生突變而后又通過多次高通量篩選最終得到色氨酸高產(chǎn)菌，并將高產(chǎn)菌進行了測序，測序結(jié)果表明生物體的染色體上和質(zhì)粒上都發(fā)生了突變，然而talB、tnaB、lplA、tyrA、gabD、gabT、aroF7個基因?qū)ι彼岬纳锖铣善鹬P(guān)鍵的作用，故對其進行了基因重組以及色氨酸含量的測定。最終發(fā)現(xiàn)染色體上的突變并沒有造成色氨酸產(chǎn)量的改變。參考文獻［1］ ［J］.生物工程進展，.［2］［J］.中國生物工程雜志，［3］［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，［4］［J］.［5］［J］. ［6］［J］.［7］［J］.［8］［J］.［9］［10］［J］.［11］［J］.［12］［J］.［13］——融合PCR［J］.［14］［J］.［15］［J］.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院畢業(yè)論文 致謝致謝本論文是在北京電子科技職業(yè)學(xué)院李曄老師和清華大學(xué)化學(xué)工程系張翀、王天民、張雪老師的悉心指導(dǎo)下完成的，從立體、實驗設(shè)計、分析以及一些觀點的提出和問題的探討中，都給于我很大的幫助。感謝李曄老師平時對我課題立體的操勞，以及對我的課題進度的關(guān)心，還有對我最終論文的指導(dǎo)。由衷的感激我的恩師金麗華老師對我就業(yè)實習以及生活上的關(guān)心與照顧，感謝她自始至終對我以及我的同學(xué)們那種無微不至的呵護，無論是生活點滴的照顧還是課題遇到困難時的鼓勵，都讓我們對目標有了十足的信心。感謝與我朝夕相處的師兄師姐蒙玄大哥、鄭翔、趙同新、郭佳薈、周益康、劉樹德、吳亦楠等給予我的幫助。感謝我的家人，感激所有給了我關(guān)心和鼓勵的同學(xué)和朋友!