透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝-資料下載頁
2024-11-07 20:29本頁面
【導(dǎo)讀】透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝主要分為二大類,以動物組織為原料的提取法和細菌發(fā)酵法。已從下列組織中分離出了透明質(zhì)酸：結(jié)締組織、臍帶、皮膚、人血清、雞冠、關(guān)。為雞冠、人臍帶和動物眼球。細菌發(fā)酵法是利用某些種屬的鏈球菌，在生長繁殖過程中，向胞外分泌以透明質(zhì)酸為主要成分的莢膜。成規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，無動物來源的致病病毒污染的危險等優(yōu)點。透明質(zhì)酸無種屬差異，不。同動物組織提取的及不同菌種發(fā)酵生產(chǎn)的透明質(zhì)酸，在化學(xué)本質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)上是一致的，2．過濾將酶解提取液用濾布加硅藻土加壓過濾，得澄清濾液。的真空干燥器內(nèi)干燥,得透明質(zhì)酸中間品。程中加少量氯仿防腐。5．酶解將水相用稀氫氧化鈉溶液調(diào),加入適量鏈霉蛋白酶,37℃酶解24h。滅菌作用，并使蛋白質(zhì)熱變性，易被蛋白酶水解。公雞冠中的透明質(zhì)酸以與蛋白質(zhì)結(jié)合狀態(tài)存在，酶解的另。提取和酶解時，應(yīng)注意防腐。8．在精制過程中，再一次使用蛋白水解酶進行酶解除蛋白質(zhì)時。
【正文】 明質(zhì) 酸的 機械 降解。在發(fā) 酵罐 上最 好加一個 溶氧 傳感 器，可以 在發(fā) 酵過 程中 在線 檢測 和控 制發(fā) 酵液 的溶 氧，并 對整 個發(fā) 酵過 程的溶氧 進 行 自 動紀 錄。 4． 在 透 明 質(zhì)酸 的發(fā) 酵過 程中 ， pH 值是 一個 重要 的因 素， 一般 控制 在 ~ 范圍內(nèi) ,最 好 在 左右 ,低于 或高 于 ,會 影響 菌體 生長 ,降 低透 明質(zhì) 酸的 產(chǎn)率 。 pH 值低 于5. 0 或 高于 ,菌 體生 長和 代謝 很慢 或停 止。發(fā) 酵過 程中，菌體 產(chǎn)生 的醋 酸和 乳酸 等小分子 有 機 酸 的總 量要 大于 透明 質(zhì)酸 ，因 此可 使發(fā) 酵液 的 pH 值以 ~低 ， 需 用 氫氧 化鈉 或碳 酸鈉 溶液 進行 中和 ，以 維持 適當 的 pH 值。 用高 濃度 的氫氧 化鈉 溶液 ， 無 需 高溫 滅菌 可直 接加 入發(fā) 酵液 中。 在發(fā) 酵罐 上安 裝一 個在 線的 pH 自 動檢測 控制 裝置 是 很 有 必要 的。 5．在搖 瓶和 種子 罐培 養(yǎng)階 段，溫 度一 般控 制在 37℃ 。發(fā) 酵溫 度一 般為 37℃ ，也 有的采用 35℃ 或 33℃ 等 較低 的溫 度，或 在不 同的 階段 采用 不同 的溫 度。在 種子 培養(yǎng) 階段 和發(fā)酵的 初期 ， 37℃ 培養(yǎng) 可使 菌體 較快 的生 長繁 殖，發(fā) 酵中 期和 后期 可適 當降 低溫 度，據(jù) 報道可使 葡 萄 糖 的代 謝方 向由 合成 菌體 細胞 壁轉(zhuǎn) 向合 成透 明質(zhì) 酸， 提高 透明 質(zhì)酸 的產(chǎn) 率和 Ｍ r。 6．藥用 級透 明質(zhì) 酸的 Ｍ r 要求 較高 ，發(fā) 酵法 生產(chǎn) 的透 明質(zhì) 酸的 平均 Ｍ r 為 1~4MDa，人們 試 圖 通 過葡 萄糖 的代 謝調(diào) 控， 來提 高透 明質(zhì) 酸的 Ｍ r。 Kitchen 等 [30]發(fā)現(xiàn) 從成 纖維 細胞（ fibroblastcells） 分 離出 的透 明質(zhì) 酸合 成酶 的半 衰期 僅有 2~4h， 大 約相 當于 一條 透明 質(zhì) 酸 分 子鏈 的合 成時 間， 于是 推斷 ：一 個透 明質(zhì) 酸分 子的 Ｍ r 或鏈 長度 ，取 決于 合成 它的 合成 酶在 其生 命期 內(nèi)可 聚合 前提 物分 子（ UDP葡 糖醛 酸和 UDPN乙 酰氨 基葡 糖）的數(shù)量 。根據(jù) 這一 理論 ，菌體 過多 的表 達透 明質(zhì) 酸合 成酶 ，酶分 子之 間會 競爭 同 一 前提 物資源 ，導(dǎo) 致 透 明 質(zhì)酸 Ｍ r 的 降低。 以 上 分 析推 斷， 為提 高透 明質(zhì) 酸的 Ｍ r 可考 慮采 用的 幾個 策略 ,這幾 個方面 的組 合， 是提高 透 明 質(zhì) 酸 Ｍ r 的關(guān) 鍵。 1） 延 長 透 明質(zhì) 酸合 成酶 的生 命期 2） 降 低 生 物量 的合 成， 以減 輕前 提物 資源 的競 爭 3） 增 加 透 明質(zhì) 酸合 成的 前提 物資 源 4） 提 高 細 胞的 能源 效率 （ energyefficiency 研 究 發(fā) 現(xiàn) ,許 多發(fā) 酵參 數(shù)可 顯著 影響 透明 質(zhì)酸的 Ｍ r。 具體 地說 ，低 發(fā)酵 溫度 （ 28℃ ），通 氣和 高初 始濃 度的 葡萄 糖（ 40g/L）可產(chǎn) 生高 Ｍ r 的透 明質(zhì) 酸（ 菌種 ： ） ,而 發(fā) 酵 液 pH 值 和攪 拌速 度對 透明 質(zhì)酸 Ｍ r 基本 無影 響。 體 在發(fā) 酵過 程中 ，不 斷向 胞外 分泌 透明 質(zhì)酸 ，在 攪拌 等作 用下 ，擴 散溶解 到發(fā) 酵液中 。隨著 發(fā)酵 液中 透明 質(zhì)酸 的積 累 ，發(fā) 酵液 的粘 度逐 漸增 高 ,在發(fā) 酵進 程中 每隔 一定 時間測定 發(fā)酵 液的 粘度 可直 觀地 反映 出透 明質(zhì) 酸的 發(fā)酵 情況 ，粘 度越 高，說 明發(fā) 酵液 中透 明質(zhì)酸的 含 量 高 、 Ｍ r 大。 子培 養(yǎng)和 發(fā)酵 過程 中菌 體密 度的 測定 是以 光吸 收度（ 660nm）或單 位體 積發(fā) 酵液中菌 體的 濕重 來表 示，每隔 一定 時間 測定 菌體 密度 可反 映出 菌體 的生 長繁 殖情 況。值 得注意的 是， 對于 同一 種菌 種， 在不 同的 發(fā)酵 條件 下， 菌體 密度 高， 但透 明質(zhì) 酸產(chǎn) 率不 一定高 ，這 說明 細菌 在某 種條 件下 ，主 要利 用葡 萄糖 進行 菌體 增殖，作為 次級 代謝 產(chǎn)物 的透 明質(zhì)酸的 合成 減少 了 ，它 不是 構(gòu)建 菌體 所必 需的 物質(zhì) 。因此 ，為了 提高透 明質(zhì) 酸的 產(chǎn)率 ，需要對發(fā) 酵 參 數(shù) 條件 和發(fā) 酵液 的配 方進 行優(yōu) 化。 9．關(guān) 于下 游分 離純 化 ，發(fā) 酵液 中的 透明 質(zhì)酸 在菌 體外 的溶 液中游 離存 在 ，提 取時 無需破碎 菌體 ，與從 動物 組織 提取 相比 ，易于 分離 純化 。首先 要殺 滅和除 去發(fā) 酵液 中的 菌體 ，通常 加 入 殺 菌劑 或 75~80℃ 加熱 進行 滅菌 。最 常用 的殺 菌劑 為三 氯乙 酸和 陰離 子表 面活 性劑 十二 烷基 硫酸 鈉（ SDS），兩 者 可配 合使 用， SDS 的 另一 作用 是使 蛋白 變性 和促 進透明質(zhì) 酸與 菌體 的分 離 。透 明質(zhì) 酸的 含量 較高 時，發(fā)酵 液的 粘度 很高 ，直 接過 濾或 離心 除菌體非 常困 難 ，需 要先 進行稀 釋 。除 菌體 后的 清液 ，經(jīng) 乙醇 沉淀 、氯 仿處 理、 CPC 沉淀 、離子交 換 、超 濾等 方法 進行 分離 純化 ，最 后用 有機 溶劑 沉淀 、真 空干 燥或 冷凍 干燥 制得 透明質(zhì)酸 精 品 。 這些 方法 與前 述從 動物 組織 提取 時的 分離 純化 方法 基本 一致 。 表 31 動物組織提取法和細菌發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的比較 10．發(fā) 酵法 生產(chǎn) 透明 質(zhì)酸 具有 產(chǎn)量 不受 動物原 料資 源限 制，成本 低，分 離純 化工 藝簡捷 ，易 于規(guī) ?；?生產(chǎn) 等優(yōu) 點（ 見表 31）， 是透 明質(zhì) 酸的 生產(chǎn) 的發(fā) 展方 向， 應(yīng)從提 高產(chǎn) 率、提高 產(chǎn) 品 Ｍ r 和分 離純 化技術(shù) 方面 進一 步深 入研 究。
研究報告相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1