【正文】 上保持大的遺傳多樣性，最好仍呈孟德爾式分離。這樣，分子標(biāo)記篩選后，仍有很大遺傳變異供育種家通過傳統(tǒng)育種方法選擇，產(chǎn)生新的品種和雜交種。這種方法對于質(zhì)量性狀或數(shù)量性狀基因的MAS均適用。本方法可分為三步：第1步：利用傳統(tǒng)育種方法結(jié)合DNA指紋圖譜選擇用，于MAS的優(yōu)異親本，特別對于數(shù)量性狀而言，不同親本針對同一目標(biāo)性狀要具有不同的重要的QTL，即具有更多的等位基因多樣性。第2步：確定該重要農(nóng)藝性狀QTL標(biāo)記。利用中選親本與測驗(yàn)系雜交，將Fl自交產(chǎn)生分離群體，一般200～300株，結(jié)合F2：3單株株行田間調(diào)查結(jié)果，以確定主要QTL的分子標(biāo)記。表型數(shù)據(jù)必須是在不同地區(qū)種植獲得，以消除環(huán)境互作對目標(biāo)基因表達(dá)的影響。標(biāo)記的QTL不受環(huán)境改變的影響，且占表型方差的最大值(即要求該數(shù)量性狀位點(diǎn)必須對該目標(biāo)性狀貢獻(xiàn)值大)。確定QTL標(biāo)記的同時(shí)將中選的親本間雜交，其后代再自交1～2次產(chǎn)生一個(gè)很大分離群體。第3步：結(jié)合QTL標(biāo)記的篩選，對上述分離群體中單株進(jìn)行SLS—MAS。第4步：根據(jù)中選位點(diǎn)選擇目標(biāo)材料，由于連鎖累贅，除中選QTL標(biāo)記附近外，其他位點(diǎn)保持很大的遺傳多樣性，通過中選單株自交，基于本地生態(tài)需要進(jìn)行系統(tǒng)選擇，育成新的優(yōu)異品系，或?qū)⒋伺c測驗(yàn)系雜交產(chǎn)生新雜種。若目標(biāo)性狀位點(diǎn)兩邊均有QTL標(biāo)記，則可降低連鎖累贅。(三)MAS聚合育種在實(shí)際育種工作中，通過聚合雜交將多個(gè)有利目標(biāo)基因壘集到同一品種材料中，培育成一個(gè)具多種有利性狀的品種，如多個(gè)抗性基因的品種，在作物抗病蟲育種中保證品種對病蟲害的持久抗性將有十分重要的作用。但是，由于導(dǎo)人的新基因表現(xiàn)常被預(yù)先存在的基因所掩蓋或者許多基因的表型相似難以區(qū)分、隱性基因需要測交檢測、或接種條件要求很高等，導(dǎo)致許多抗性基因不一定在特定環(huán)境下表現(xiàn)出抗性，造成基于表型的抗性選擇將無法進(jìn)行。MAS可利用分子標(biāo)記跟蹤新的有利基因?qū)?，將超過觀測閾值外的有利基因高效地累積起來，為培育含有多抗、優(yōu)質(zhì)基因的品種提供了重要的途徑。利用MAS技術(shù)在快速壘集基因方面表現(xiàn)出巨大的優(yōu)越性。農(nóng)作物有許多基因的表現(xiàn)型是相同的，通過經(jīng)典遺傳育種研究無法區(qū)分不同基因效應(yīng)，從而也就不易鑒定一個(gè)性狀的產(chǎn)生是由于一個(gè)基因還是多個(gè)具有相同表型的基因的共同作用。借助分子標(biāo)記，可以先在不同親本中將基因定位，然后通過雜交或回交將不同的基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)品種中去，通過檢測與不同基因連鎖的分子標(biāo)記有無來推斷該個(gè)體是否含有相應(yīng)的基因，以達(dá)到聚合選擇的目的。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所與揚(yáng)州農(nóng)科所合作，借助于MAS完成了Pm4a+Pm2+PmPm2+Pm6+Pm2Pm4a+Pm21等小麥白粉病抗性基因的聚合，從而拓寬了現(xiàn)有育種材料對白粉病的抗譜，提高了抗性的持久性。利用具有單個(gè)不同抗性基因的4個(gè)親本，通過MAS三個(gè)世代即可獲得同時(shí)具有四個(gè)抗性基因的個(gè)體。國際水稻所Mackill利用MAS對水稻稻瘟病抗性基因Pi—pizpita進(jìn)行累集，獲得了抗兩種或三種小種的品系。利用RAPD與RFLP標(biāo)記，Yoshimura等已將水稻白葉枯抗性基因Xal、XaXaXa5與Xa10等基因進(jìn)行了不同方式的聚合。在水稻中已將含有抗白葉枯基因Xa21的材料與抗蟲基因材料雜交，利用Xa21的STS標(biāo)記獲得了同時(shí)具有Xa2，和抗蟲基因的材料曠通常應(yīng)用MAS聚合不同基因時(shí)，F(xiàn)2分離群體大小應(yīng)以200～500株為宜，先對易操作的分子標(biāo)記進(jìn)行初選，再進(jìn)行復(fù)雜的RFLP驗(yàn)證，可提高聚合效率。隨著育種目標(biāo)的多樣性，為了選育出集高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲等優(yōu)良性狀于一身的作物新品種，應(yīng)考慮目標(biāo)性狀標(biāo)記篩選時(shí)親本選擇的代表性，即最好選擇與育種直接有關(guān)的親本材料，所構(gòu)建群體也最好既是遺傳研究群體，又是育種群體，在此基礎(chǔ)上，多個(gè)目標(biāo)性狀的聚合需通過群體改良的方法實(shí)現(xiàn)。不容置疑，分子標(biāo)記技術(shù)賦予了群體改良新的內(nèi)涵，借助于分子標(biāo)記技術(shù)可快速獲得集多個(gè)目標(biāo)農(nóng)藝性狀于一身的作物新品種。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所在多目標(biāo)性狀聚合的修飾回交方法育種的基礎(chǔ)上，提出了MAS的修飾回交聚合育種方法。修飾回交是將雜種品系間雜交和回交相結(jié)合的一種方法，即回交品系間的雜交法。將各具不同優(yōu)良性狀的雜交組合分別和同一輪回親本進(jìn)行回交，獲得各具特點(diǎn)的回交品系，再把不同回交品系進(jìn)行雜交聚合。目前利用分子標(biāo)記技術(shù)可對目標(biāo)性狀進(jìn)行前景選擇，對輪回親本的遺傳背景進(jìn)行背景選擇，就可以達(dá)到快速打破目標(biāo)性狀間的負(fù)相關(guān)，獲得聚合多個(gè)目標(biāo)性狀新品系的目的(圖17—8)。三、提高分子標(biāo)記的篩選效率(一)多重PCR方法為了增加標(biāo)記的篩選效率，當(dāng)同時(shí)篩選到與2個(gè)或2個(gè)以上目標(biāo)性狀連鎖的幾個(gè)不同的分子標(biāo)記時(shí)，如果這幾個(gè)分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物具有不同長度，則一對以上的引物可在同一PCR條件下同時(shí)反應(yīng)，這稱為多重?cái)U(kuò)增。利用這種方法時(shí)需注意，設(shè)計(jì)或選擇引物時(shí)，必須考慮各引物復(fù)性溫度是否相匹配，且在擴(kuò)增產(chǎn)物的大小上無重疊。研究表明，多重?cái)U(kuò)增使用Taq酶量與一個(gè)引物擴(kuò)增用量相同。這顯著地降低了選擇成本費(fèi)用和篩選時(shí)間。如Ribaut等將篩選到的與熱帶玉米抗旱基因QTL連鎖的1個(gè)STS，2個(gè)SSR標(biāo)記使用多重?cái)U(kuò)增方法用于MAS選擇，以改良其耐旱性，兩人僅用了一個(gè)月就從BC2F1的2300個(gè)單株中選出300個(gè)目標(biāo)單株。(二)用相斥相分子標(biāo)記進(jìn)行育種選擇所謂相斥相分子標(biāo)記指與目標(biāo)性狀相斥連鎖的分子標(biāo)記，即有分子標(biāo)記，植株不表現(xiàn)目標(biāo)性狀；無分子標(biāo)記，植株表現(xiàn)目標(biāo)性狀。這些選擇特別在一些顯性標(biāo)記如RAPD標(biāo)記中，效果較為顯著。Haley等(1994)找到與菜豆普通花葉病毒隱性抗病基因bc—3連鎖的兩個(gè)RAPD標(biāo)記，其中標(biāo)記—1與bc—3相引，距離為1．9cM；標(biāo)記—2與bc—3相斥，距離為7．1cM。用標(biāo)記—1選擇的純合抗病株、雜合體、純合感病株分別占26．3％，72．5％和1．2％。而用標(biāo)記—2選擇的結(jié)果分別是81．8％，18．2％和0。當(dāng)將兩個(gè)標(biāo)記同時(shí)使用時(shí)，即相當(dāng)于一個(gè)共顯性標(biāo)記。其選擇效果與單獨(dú)使用標(biāo)記—2的選擇效果一致。一般認(rèn)為，在育種早代選擇中，利用相斥相的RAPD標(biāo)記，與共顯性的RFLP標(biāo)記具有相似的選擇效果。(三)克服連鎖累贅回交育種是作物育種常用的育種方法，但回交育種中長期存在的問題是在回交過程中，目的基因與其附近的非目的基因存在連鎖，一起導(dǎo)人受體，這種現(xiàn)象稱為連鎖累贅(Linkage drag)。利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇可以顯著地減輕連鎖累贅的程度。如在大約150個(gè)回交后代中，至少有一個(gè)植株在其目的基因左側(cè)或右側(cè)lcM范圍內(nèi)發(fā)生一次交換的可能性為95％，利用RFLP標(biāo)記可以精確地選擇出這些個(gè)體；在另一個(gè)有300個(gè)植株的回交群體中，有95％的可能在被選擇基因另一側(cè)lcM范圍內(nèi)發(fā)生一次交換，從而產(chǎn)生目的基因大于2cM的片段。這個(gè)結(jié)果用RFLP選擇只需2個(gè)世代就能夠得到；而傳統(tǒng)的方法可能平均需要100代。隨著分子標(biāo)記圖譜的更加密集，選擇重組個(gè)體的效率將進(jìn)一步提高。因此，高密度的作物分子遺傳圖譜的構(gòu)建是加速作物育種進(jìn)程所必需的。(四)降低MAS育種的成本進(jìn)行MAS，首先是需把與目標(biāo)基因(性狀)緊密連鎖(或共分離)的分子標(biāo)記如RFLP、RAPD等轉(zhuǎn)化為PCR檢測的標(biāo)記。然后設(shè)法降低PCR篩選成本?？蓮囊韵聨追矫婵紤]：①樣品DNA提取。采用微量提取法如利用小量組織或半粒種子且不需液氮處理的DNA提取技術(shù)。且在提取過程中不利用特殊化學(xué)藥品，降低提取緩沖液成本。②減少PCR反應(yīng)時(shí)的體積。如反應(yīng)時(shí)的體積從25μ1減到15μ1甚至10μ1。③瓊脂糖(Agrose)凝膠：實(shí)驗(yàn)表明同一Agrose膠可以多次電泳載樣，而不會造成樣品間互相干擾。④擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：通常PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用EB染色，LTV觀測，使用Polaroid film照相系統(tǒng)。利用這種觀測方法，不僅有致癌誘導(dǎo)劑，而且UV射線對眼睛損害很大，照相系統(tǒng)花費(fèi)也很高。通過改造染色系統(tǒng)，利用美藍(lán)又稱亞甲藍(lán)、甲烯藍(lán)(Methyleneblue)染瓊脂糖凝膠，可直接在可見光下檢測。甚至若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅一種，則無需電泳，只需在反應(yīng)管中加入EB，紫外燈下直接根據(jù)反應(yīng)即可鑒定出目標(biāo)基因型，大大降低了標(biāo)記輔助選擇成本，非常有利于大規(guī)模育種。這在中國春小麥Phlb基因的SCAR標(biāo)記篩選上已有成功嘗試。近十年多來，分子標(biāo)記的研究已經(jīng)得到快速發(fā)展，在許多作物中已定位了很多重要性狀的基因，但育成品系或品種的報(bào)道還相對較少。究其原因主要有：①標(biāo)記信息的丟失。標(biāo)記仍然存在，但由于重組使標(biāo)記與基因分離，導(dǎo)致選擇偏離方向；②QTL定位和效應(yīng)估算的不精確性；③上位性的存在，由于QTL與環(huán)境、QTL與QTL間存在互作，導(dǎo)致不同環(huán)境、不同背景下選擇效率發(fā)生偏差；④標(biāo)記鑒定技術(shù)有待進(jìn)一步提高。盡管近年來標(biāo)記鑒定技術(shù)在實(shí)用性及降低成本方面都得到了很大發(fā)展，但對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來說，MAS還是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)耗資的工作。盡管目前MAS的成功應(yīng)用還存在諸多困難，但MAS在未來作物育種中的作用是毋庸置疑的。相信在不久的將來，隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及各種作物圖譜的日趨飽和，MAS會發(fā)揮它應(yīng)有的作用。