【正文】 AT 774 OPG18/943 TGTCGTTTGACCGCACATCTTATTTAACGAATTTATAAAAAAAATAAAAAAAAGTCGCGCATAAAATATTATTCATGTTTTATCAT 774 OPG18/972 CTAATAGCAACAAAAATACTAATCAAAAAGTTTAAAACAAAACGAACGATCAAACTTTAGACATAGAAATCCACATACATACTTAA 860 OPG18/943 CTAATAGCAACAAAAATACTAATCAAAAAGTTTAAAACAAAACGAACGATCAAACTTTAGACATAGAAATCCACATACATACTTAA 860 OPG18/972 AATGGAACGGAAGAAGTATATATACACCCTAGTTTACGACCTTAATTAGTCCTACTCCCCTGGACACTGCCCTCTTCTTTAATTAA 946 OPG18/943 AAGTTTACGACCTTAATTAGTCCTACTCCCCTGGACACTGCCCTCTTCTTTAATTAA 946 OPG18/972 CTAAATAATTAATTAACACATGAGCC 1032 OPG18/943 CTAAATAATTAATTAACACATGAGCC 1032 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 Sequences of primers for each SCAR locus derived from RAPD markers SCAR markers Primers origin Primers sequences Polymorphism SCAR/G18/883 OPG18/943 正向 : GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT Dominant in N8m 反向 : GGACTAATTAAGGTCGTAAACTTTT SCAR/G18/890 OPG18/972 正向 : GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT Dominant in N8 反向 : AGGGTGTATATATACTTCTTCCG SCAR/G18/919/948 OPG18/943 OPG18/972 正向 : GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT Codominant in N8m and N8 反向 : AGTTAATTAAAGAAGAAGGCAGTGTCC SCAR/D10/1237 OPD10/1248 正向 : GTCTACACCTTATTATTGCACAC Dominant in N8 反向 : AAGATCGACTAAGGCGAGTACGAC SCAR/F03/1186 OPF03/1198 正向 : GATCACCTCCTCCTGTGAGCA Dominant in N8m 反向 : CACAACCATTGACAGTAACCAAGAAG 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 SCAR markers between Norin8 and Norin 8m M — λDNA+ EcoR I+Hind Ⅲ molecular marker 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?獲得了 5個(gè) SCAR標(biāo)記： ?SCAR/G18/890、 ?SCAR/G18/88 ?SCAR/G18/919/94 ?SCAR/D10/123 ?SCAR/F03/1186， 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 主題二、 任意引物 PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP— PCR)標(biāo)記技術(shù) ?創(chuàng)立： Welsh和 McClilland等， 1990年。 ? Welsh J et al, Nucl Acids Res, 1990, (18): 7213 ?引物： ? 引物較長(zhǎng) (10－ 50 bp)；長(zhǎng)度不定，常來自為其它目的而設(shè)計(jì)的引物（如 M13通用測(cè)序引物， T3和 T7啟動(dòng)子通用引物）。 ? 濃度較高 ? PCR反應(yīng) 分為兩個(gè)階段： ? 首先寡核昔酸引物在 低嚴(yán)謹(jǐn)條件 下與模板 DNA退火，此時(shí)發(fā)生了一些合成，以便穩(wěn)定模板與引物之間相互作用。 ? 然后進(jìn)行 高嚴(yán)謹(jǐn)退火 條件的循環(huán)，兩個(gè)位點(diǎn)間那些序列在低嚴(yán)謹(jǐn)度退火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下擴(kuò)增。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?結(jié)果分析： 通常采用變性 聚丙烯酞胺凝膠電泳或高分辨率的瓊脂糖膠 分析 PCR產(chǎn)物，最終反應(yīng)結(jié)果與RAPD類似。只要設(shè)計(jì)的引物在低嚴(yán)謹(jǐn)退火條件下能減少引物產(chǎn)生人為產(chǎn)物，應(yīng)用成對(duì)組合的引物可以產(chǎn)生新的 AP— PC R譜帶，但引物配對(duì)組合使用時(shí)，得到的圖譜與單引物單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的圖譜之和很不相同。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?特點(diǎn)： AP— PCR方法不需預(yù)知序列資料，而且檢測(cè)的基因組樣本是任意的，還能夠用于檢測(cè)近等基因系 (或同類系 )中的多態(tài)性。 AP— PCR的缺點(diǎn)是每個(gè)新的多態(tài)性都必須經(jīng)純化才能進(jìn)一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可辨別長(zhǎng)度多態(tài)性。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 主題三、 DNA擴(kuò)增指紋印跡 ( DNA amplification fingerprinting , DAF)標(biāo)記技術(shù)： ?創(chuàng)立： CaetanoAnolles等， 1990年。 ?與 RAPD不同的是 : 引物濃度更高，引物長(zhǎng)度更短（一般 5－ 8個(gè)堿基），且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型，譜帶信息比RAPDs大得多。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 小 結(jié)： ? RAPD、 APPCR和 DAF共同優(yōu)點(diǎn)： 在不需要知道所擴(kuò)增 DNA序列情況下，產(chǎn)生 DNA 片段的指紋；需 DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。 ? RAPD、 APPCR和 DAF共同缺點(diǎn)： 對(duì)反應(yīng)條件非常敏感，重復(fù)性差。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 第四節(jié) SSR標(biāo)記技術(shù)和 ISSR標(biāo)記技術(shù) ?主題一、簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（ Simple sequence repeat, SSR) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? Satellite DNA： 真核生物基因組酶切、離心后，在主帶附近會(huì)出現(xiàn)（ AT）含量很高的簡(jiǎn)單高度重復(fù)序列。 ? Minin Satellite DNA: 1570 bp ? Microsatellite DNA： 一類由幾個(gè)核苷酸（一般 16個(gè)，基序很短）為重復(fù)單位串聯(lián)而成的 DNA序列。繼 RFLP之后的第二代分子標(biāo)記。多態(tài)性好、重復(fù)好、共顯性標(biāo)記 SSR（ Simple sequence Repeat ） = microsatellite= STR (Short Tandem Repeat,） 一、引 言 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 二、 SSR標(biāo)記技術(shù)的原理 ?SSR即微衛(wèi)星 DNA (Microsatellite DNA) 標(biāo)記； ?屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元 1~6 bp， 如 (CA)n、(AT)、 (GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十 ~幾百 bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。 呈現(xiàn)孟德爾式遺傳 。目前微衛(wèi)星 DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個(gè)位點(diǎn)。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 由于微衛(wèi)星 DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列，因此，可以根據(jù)其兩端序列的保守性，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行 PCR，通過 PCR將其間微衛(wèi)星序列擴(kuò)增出來，再電泳分離，染色顯帶以檢測(cè)微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。 ?…… TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC…… ?…… AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG…… ? SSR標(biāo)記技術(shù)的原理 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 不同材料間重復(fù)次數(shù)的不同 ， 導(dǎo)致了 SSR長(zhǎng)度的高度變異性。 ? SSR標(biāo)記技術(shù)的原理 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?廣泛存在： 真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布 ,大約每隔 1050 kb就存在一個(gè) SSR。 ?不同物種其重復(fù)序列間隔不同： 哺乳動(dòng)物中約為植物的 56倍；植物中平均 SSR；雙子葉植物 SSR數(shù)量大于單子葉植物，核 DNA SSR數(shù)量多于細(xì)胞質(zhì) DNA。 三、 SSR的分布特點(diǎn) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?不同物種重復(fù)單位及其頻率不同。 不同物種中微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率變化是非常大的： 如在主要的農(nóng)作物中兩種最普遍的二核苷酸重復(fù)單位(AC)n和 (GA)n，但在水稻、小麥、玉米、煙草中的數(shù)量分布頻率是不同的。在小麥中估計(jì)有 3000個(gè) (AC)n序列重復(fù)和約 6000個(gè) (GA)n序列重復(fù)，兩個(gè)重復(fù)之間的距離平均分別為 704kb、 440kb，而在水稻中， (AC)n序列重復(fù)約有 1000個(gè)左右， (GA)n重復(fù)約有 2022個(gè)，重復(fù)之間的平均距離分別為 450kb、 225kb。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 另外在植物中也發(fā)現(xiàn)一些三核苷酸和四核苷酸的重復(fù)，其中最常見的是 (AAG)n、 (AAT)n。在單子葉和雙子葉植物中 SSR數(shù)量和分布也有差異，平均分別為 kb和 kb中有一個(gè) SSR。 研究還發(fā)現(xiàn)，單核苷酸及二核苷酸重復(fù)類型的 SSR主要位于非編碼區(qū)，而有部分三核苷酸類型位于編碼區(qū)。 另外在葉綠體基因組中，目前也報(bào)道了一些微衛(wèi)星，以 A/T ? 同一物種堿基種類不同的 SSR，豐度差別很大。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 四、 SSR的功能 長(zhǎng)期以來一直認(rèn)為 SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒有明確的生理功能。但隨著研究深入，證明并非如此。 SSR的主要功能 : ?編碼氨基酸； ?染色體末端的 SSR，有保護(hù) DNA完整性、避免降解、融合及丟失的功能； ?提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率； ?基因重組的熱點(diǎn)，是基因變異的來源； ?部分 SSR可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物或活化染色體。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 四、 SSR標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： ? 兩側(cè)順序保守，在 同種間 多相同，因此，設(shè)計(jì)的 引物可以 通用 。 ? 數(shù)量豐富 ，在整個(gè)基因組均勻隨機(jī)分布。 ? 實(shí)驗(yàn) 重復(fù)性好 ，結(jié)果可靠。 ? 多數(shù) SSR增減重復(fù)序列頻率高，在品種間具 廣泛位點(diǎn)變異 。 ? 共顯性 標(biāo)記，可鑒別雜合子和純合子。 ? 僅需微量組織， 適合 PCR分析 半自動(dòng)化 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?相對(duì)的物種專一性； ?由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，即 需建立基因文庫、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過程， 開發(fā)困難 ， 費(fèi)用較高 ，耗時(shí)長(zhǎng)；因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。 ?實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)； ?不同引物退火溫度不同，需要探索。 ?不 足： 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 五、 SSR標(biāo)記技術(shù)的操作步驟 基因組文庫的構(gòu)建 探針制備 預(yù)雜交 帶有 SSR克隆的選擇 測(cè)序 引物設(shè)計(jì) 檢測(cè) 其它方法 : ESTSSR、相關(guān)種間 SSR... ... 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?獲取 SSR引物的方法： ?直接利用相關(guān)文獻(xiàn)中提供的引物 : 如：有關(guān)水稻的 SSR引物： ? 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張啟發(fā)） ? 美國(guó) Cornell Uinversity（ Wu Rai）。 ?根據(jù) 的數(shù)據(jù)。 ?。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué)