【正文】 KH. Diagnosis of tumor by fluorescence: quantification of photosensitizer concentration[J]. Proc SPIE, 1990, 1203:1218.[57] Pandey R. K., Shiau F. Y.,Ieunier M.,et al. Improved photosensitizers for photodynamic therapy[J]. Proc. SPIE, 1992, 54:264273.[58] [D]. 福建師范大學(xué)，2003.第二章 二氫卟吩e6的增量合成據(jù)文獻報道，二氫卟吩e6 及其衍生物均為優(yōu)良的光敏劑，它們具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，且在紅光區(qū)（λ＞600nm）吸收系數(shù)較目前國內(nèi)外臨床使用的卟啉類制劑高一個數(shù)量級，光敏作用強，且在體內(nèi)清除速度快，毒性小等特點，已成為光動力治癌新藥發(fā)展中頗受關(guān)注的研究對象[1,2]。郝建冬[3]建立了檢測二氫卟吩e6的HPLC方法和二氫卟吩e6的合成及純化方法。但其論文及目前文獻報道的二氫卟吩e6制備方法，均為小劑量制備，中、大劑量合成及純化均未見報道。另外，郝建冬論文中關(guān)于二氫卟吩e6及其衍生物的HPLC檢測方法只討論了單一的色譜條件，缺乏對比性；且沒有進行關(guān)于HPLC方法學(xué)考察的實驗，無法對其建立的色譜條件進行評價。為解決上述問題，本章通過研究不同的色譜條件來選擇，找出一個選擇性強、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好的色譜分析方法來檢測二氫卟吩 e6；確定用于檢測增量合成的二氫卟吩 e6樣品純度及組成的檢測方法，此外，還對二氫卟吩e6進行了增量化合成及純化實驗，為實現(xiàn)光敏劑二氫卟吩e6的工業(yè)化制備、分離提供了科學(xué)依據(jù)；開發(fā)一種新的、無毒的，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)的二氫卟吩e6的制備方法。 實驗部分 儀器、藥品及試劑主要試劑：葉綠素粗品 浙江海寧天然色素廠二氫卟吩e6標(biāo)準(zhǔn)品 Frontier Scientific（USA）二氫卟吩e6粗品 實驗室自制甲醇（HPLC） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司重蒸水 實驗室自制主要儀器：Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters 公司W(wǎng)aters 2487紫外檢測器 美國Waters 公司PLATISIL ODS 5μm (250mm) 色譜柱 迪馬科技公司UV2550 紫外可見分光光度計 日本島津公司 實驗方法 二氫卟吩e6的高效液相色譜法，用津騰 PVDF濾膜過濾（）過濾。考慮到樣品的強光敏性，所有的溶液均存放在棕色瓶中，并且為新配制的。分離過程中使用的色譜柱是PLATISIL ODS 5μm (250mm)，用不同的流動相在23177。1℃下進行洗脫。手動進樣量10μL。 二氫卟吩e6的增量合成與純化1. 合成路線本實驗合成路線如下：蠶沙葉綠素經(jīng)酸降解制得脫鎂葉綠酸a，脫鎂葉綠酸a于無氧條件下經(jīng)堿降解制得二氫卟吩e6。圖21 二氫卟吩e6的合成路線Fig. 21 The total synthesis route of chlorine e62. 增量合成實驗參考文獻[3]得出的合成二氫卟吩的最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)體系隔絕氧氣，并通入氮氣，于140℃回流25min。對二氫卟吩e6進行增量化合成。首先采用文獻中的小劑量原料（）進行合成實驗，驗證方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。隨后，逐漸增大反應(yīng)物的用量至15g。經(jīng)HPLC檢測產(chǎn)物含量穩(wěn)定。3. 增量純化實驗采用氯仿為溶劑，用溶劑萃取法對二氫卟吩e6進行增量化分離提純實驗，從反應(yīng)時間、萃取劑用量上討論了兩個條件對提純效果的影響。選出最佳萃取條件后，從小劑量（）純化實驗開始，逐漸增大溶質(zhì)的用量至12g，經(jīng)HPLC檢測提純效果較好。 二氫卟吩e6的制備新法取3g脫鎂葉綠酸溶于70ml 25% KOHCH3CH2OH溶液，抽真空，通N2條件下回流25min，稍冷，加水150ml，用10% 硫酸中和至pH 56,過濾，干燥后稱重。取干燥后的二氫卟吩e6粗品用氯仿進行溶劑法萃取，干燥后經(jīng)HPLC檢測。 結(jié)果與討論 二氫卟吩e6的高效液相色譜法生產(chǎn)藥物制劑的一個最重要的方面是控制和檢測活性物質(zhì)的純度，在制備過程中的含量、重現(xiàn)性和在保質(zhì)期中的穩(wěn)定性[4]。因此，研究出一種可靠的、有重現(xiàn)性的定量和定性檢測新型光敏劑組成的檢測方法是保證二氫卟吩e6產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要問題。本節(jié)工作的主要目的是通過研究不同的色譜條件來選擇并找出一個專屬性好、準(zhǔn)確性高、有重現(xiàn)性的色譜分析方法來確定二氫卟吩 e6純度和雜質(zhì)含量。 檢測波長選擇利用二氫卟吩e6的結(jié)構(gòu)（圖22）在甲醇溶液進行吸收光譜實驗，得到圖23。 圖22 二氫卟吩e6的結(jié)構(gòu)圖Fig. 22 Chemical structure of chlorine e6圖23 二氫卟吩e6甲醇溶液的吸收光譜（溶液中Ce6的濃度為8107 mol/L）Fig. 23 Absorption spectra of chlorin e6 in ethanol（Concentration of chlorin e6 in solutions was 8107 mol/L）從圖23可知，二氫卟吩e6在可見光區(qū)分別有402177。4nm（S帶，ε = 150,000 cm?1 M?1）和660177。5nm（Q帶，ε = 45,000 cm?1 M?1）兩個最強吸收峰。盡管二氫卟吩e6的長波吸收在660nm，目前的分析工作仍在S帶進行檢測。選擇S帶波長是因為在S帶檢測有較高的靈敏性，物質(zhì)在S帶的吸收強度是Q帶的3倍。另外，二氫卟吩e6樣品中潛在的一系列雜質(zhì)（大多數(shù)卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)）在660nm也有強吸收[5]。物質(zhì)的紫外吸收光譜隨溶液pH值不同而異，為了篩選HPLC條件中所需的檢測波長，對溶于不同pH值流動相中的二氫卟吩e6進行紫外可見吸收光譜檢測，見圖24；，見圖25。圖24 （溶液中Ce6的濃度為8107 mol/L）Fig. 24 Absorption spectra of chlorin e6 in pH condition（Concentration of chlorin e6 in solutions was 8107 mol/L）圖25 （溶液中Ce6的濃度為8107 mol/L）Fig. 25 Absorption spectra of chlorin e6 in pH condition（Concentration of chlorin e6 in solutions was 8107 mol/L）在檢測方法中，檢測波長的選擇依據(jù)是二氫卟吩e6在相關(guān)流動相中的最大吸收波長：，二氫卟吩e6的HPLC檢測波長取400nm；由圖25可知，二氫卟吩e6的HPLC檢測波長取407nm。 流動相和洗脫條件選擇為了找到分離二氫卟吩類結(jié)構(gòu)化合物的最佳方法，參考文獻中的HPLC分析方法[1,5,6]，我們研究了3種不同模式的液相分析方法，得到的各種方法的最佳洗脫條件列于表21。試圖通過不同的液相條件分析二氫卟吩e6樣品，從而找出專屬、準(zhǔn)確、高效的HPLC分析方法。表21 HPLC分析Ce6的各種方法Table 21. Conditions of HPLC analysis for chlorin e6 under investigation方法色譜柱流動相B相的梯度洗脫百分率流速檢測波長AB1PLATISIL ODS醋酸銨溶液(, )甲醇62(%/min)—85(8min)—85(%/min)—1001mL/min400nm2PLATISIL ODS醋酸銨溶液(,)甲醇85(%/min)—1001mL/min407nm3PLATISIL ODS醋酸銨溶液(,)甲醇70(6min)—70(2%/min)—1001mL/min400nm —甲醇作為緩沖液，在檢測波長為400nm處進行梯度洗脫：62(%/min)—85(8min)—85(%/min)—100。用此方法檢測二氫卟吩e6得到圖26。圖26 二氫卟吩e6在醋酸銨(, )—甲醇條件下的色譜圖Fig. 26 Chromatogram of chlorin e6 in ammonium acetate solution (, )—methanol由圖26可知，雖然二氫卟吩e6的出峰時間短（30min），二氫卟吩e6色譜峰與臨近峰的分離度也較好（Rs2），但二氫卟吩e6的色譜峰有明顯拖尾，峰形較差，且該方法中用到的高濃度緩沖鹽會影響色譜柱和泵的壽命。 —甲醇作為緩沖液，在檢測波長為407nm處進行梯度洗脫：70(6min)—70(2%/min)—100。用此方法檢測二氫卟吩e6得到圖27。圖27 二氫卟吩e6在醋酸銨(, )—甲醇條件下的色譜圖Fig. 27 Chromatogram of chlorin e6 in ammonium acetate solution (, )—methanol由圖27可知，雖然二氫卟吩e6的出峰時間也較短（30min），但二氫卟吩e6色譜峰不能與臨近峰完全分離，有重疊峰，且拖尾嚴(yán)重（Tf =），峰形較差。 —甲醇作為緩沖液，在檢測波長為400nm處進行梯度洗脫：85(%/min)—100。用此方法檢測二氫卟吩e6，得到圖28。圖28 二氫卟吩e6在醋酸銨(, )—甲醇條件下的色譜圖Fig. 28 Chromatogram of chlorin e6 in ammonium acetate solution (, )—methanol由圖28可知，雖然二氫卟吩e6出峰時間相對較長（40min），但二氫卟吩e6與臨近各峰分離度好，Rs均大于2，峰形也較好，這種方法的檢測結(jié)果具有重現(xiàn)性并且二氫卟吩e6色譜峰與各雜質(zhì)峰均被良好分離。綜上所述三種方法，方法2的條件是應(yīng)用高效液相色譜法檢測二氫卟吩e6的最佳條件，論文中有關(guān)檢測二氫卟吩e6的高效液相色譜法條件均采用這個條件進行。 二氫卟吩e6 HPLC圖譜方法學(xué)驗證1. 線性關(guān)系及檢測限為了提供利用HPLC對二氫卟吩e6產(chǎn)品進行檢測的范圍及評價HPLC檢測方法的靈敏度，、1和2 mg/ml的二氫卟吩 e6標(biāo)準(zhǔn)溶液，取10 μL進樣，測定峰面積。以峰面積對濃度做曲線，計算出回歸方程；以信噪比為3確定方法的檢出限，結(jié)果見表22。表22 回歸方程，線性關(guān)系及檢出限Table22. regression equation, correlation coefficient and detection limit分析物Analyte回歸方程Regression Equation相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍Linear range(mg/mL)檢出限LOD (mg/mL)二氫卟吩 e6y=107x +107~2~2 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2. 日內(nèi)穩(wěn)定性 —甲醇作為緩沖液，在檢測波長為400nm處進行85(%/min)—100梯度洗脫的HPLC色譜條件下二氫卟吩e6的日內(nèi)穩(wěn)定性， mg/ml的二氫卟吩 e6標(biāo)準(zhǔn)溶液，取10 μL進樣，測定峰面積。每1 h進樣1次，8 h內(nèi)峰面積的結(jié)果列于表23中。表23 日內(nèi)穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table23. Result of stability in a day 時間(h)12345678結(jié)果RSD峰面積(107)%從表23中可知，8 %，說明二氫卟吩 e6在常溫下較穩(wěn)定，不易分解（避光條件下）。3. 精密度 —甲醇作為緩沖液，在檢測波長為400nm處進行85(%/min)—100梯度洗脫的HPLC色譜條件下二氫卟吩e6的日精密度， mg/mL的二氫卟吩 e6標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖檢測結(jié)果于表24中。表24 精密度實驗結(jié)果Table24. Result of precision test 進樣序號123456結(jié)果 RSD峰面積(107)%從表24中可知，%，說明用該方法檢測二氫卟吩e6的精密度較高。通過上述實驗建立了一種定性和定量的分析二氫卟吩e6及含有二氫卟吩 e6及其衍生物的樣品的反相HPLC及UV檢測方法。采用PLATISIL ODS (5μm , 250mm)色譜柱以pH mol/L的醋酸銨—甲醇溶液作為流動相進行反相梯度洗脫；梯度洗脫條件：甲醇85%（%/min）→100%； mL?min1的流速進行梯度洗脫，檢測波長為407 nm。~2 mg/ml范圍內(nèi)線性良好，r=，%。本方法操作簡單，專屬性強，靈敏度高，可用來分析含有眾多降解產(chǎn)物的二氫卟吩 e6樣品。 二氫卟吩e6的增量合成與