【導(dǎo)讀】氧概曲潰堯眾豺砒月座掛氖宛癰賭鄉(xiāng)淺喘沽四賊逗褥芽幽僚滓涌塊叔脖椅付榜頹酥壽忱靖癢爸筷漲韋繭甕他兼搬材宵鋪蓑團(tuán)掄汁真滔烯彭

　　

【正文】 得 20%的馬鈴薯浸汁。 再將準(zhǔn)確稱取 10g 葡萄糖和 18g 瓊脂，分別將它們放于上述馬鈴薯浸汁中煮沸，充分溶解或融化，再一次的補足失去的水份。 將上述 PDA 培養(yǎng)基加熱溶化后，迅速倒于帶有膠管和管夾的漏斗中，迅速適量地灌入各標(biāo)準(zhǔn)試菅中，每支試菅 8mL 左右。加蓋合適的棉塞和用牛皮紙包好后，放入高壓滅菌鍋中， 121℃滅菌 20min，取出后擺成斜面，冷卻至室溫。 在消好毒和滅好菌的超凈工作臺上接種保藏菌種，進(jìn)行菌種活 化，置于恒溫培養(yǎng)箱中， 28℃培養(yǎng) 48~72 h。 （ 2）液體種子的制備 將 100mL 液體培養(yǎng)基放入 250mL 三角瓶中，加蓋合適的棉塞，用牛皮紙將瓶口包好后，放入高壓滅菌鍋中，于 126℃滅菌 30min，取出后冷卻至室溫。在消好毒和滅好菌的超凈工作臺上接種活化好的斜面菌種 2~3 環(huán)于液體種子培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 28℃和 120 rpm 搖床培養(yǎng) 72 h。 （ 3）固體發(fā)酵 取 30g 稻草粉放入飯盒中，加固體發(fā)酵培養(yǎng)基 100mL，混拌均勻后，用牛皮紙包好，放入高壓滅菌鍋中，于 126℃滅菌 40min，取出后冷卻至 室溫。 在消好毒和滅好菌的超凈工作臺上進(jìn)行接種，將液體種子按 10%接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中， 28℃培養(yǎng) 72 h。 （ 4）纖維素酶粗提液的制備 將發(fā)酵好的固體發(fā)酵物加入稻草粉重量 6 倍蒸餾水的體積浸提 1 h， 8 層紗布過濾，再將濾液 4 000rpm 離心 15 min，即可得到纖維素酶粗提液。 2. 纖維素酶活力測定 測定方法見附錄 1。 五、結(jié)果與分析 纖維素酶產(chǎn)率（ U/g） = 浸提液總體積（ mL）179。查標(biāo)準(zhǔn)曲線毫克數(shù)（ mg）179。 發(fā)酵稻草干重（ g）179。測定時所用發(fā)酵液的體 積（ mL） 式中： 為 1mg 葡萄糖的 μmol數(shù)，即 1000/180=。 六、結(jié)論和討論 思考題： 1. 保藏菌種為什么要進(jìn)行活化？ 2. 發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶對培養(yǎng)基有什么要求 ？ 32 實驗五 纖維素酶生產(chǎn)（二） 一一 分級鹽析純化纖維素酶 一、目的 學(xué)習(xí)分級鹽析法從發(fā)酵液中分離純化酶制劑的基本操作程序。 二、原理 發(fā)酵液中除含有目的產(chǎn)物外，通常還有未被利用的培養(yǎng)基、細(xì)胞碎片、細(xì)胞代謝物等其它雜質(zhì)，分離純化的目的就是要把產(chǎn)物和雜質(zhì)分開。常用的發(fā)酵產(chǎn)物分離方法包括：過濾、離心、沉淀、濃縮等。過 濾和離心法可直接除去發(fā)酵液中的固體顆粒，而與目的產(chǎn)物分子大小相近的可溶性雜質(zhì)通常采用選擇沉淀的方法去除。根據(jù)不同蛋白質(zhì)在不同濃度中性鹽溶液中的溶解度不同，可將纖維素酶與雜蛋白分離，達(dá)到濃縮和純化的目的。 三、主要實驗儀器及試劑 1. 實驗儀器 （ 1）可見分光光度計 （ 2）離心機(jī) （ 3）電熱恒溫水浴鍋 （ 4）燒杯： 500mL179。 1 （ 5）刻度試管： 20mL179。 11 （ 6）離心管： 10mL179。 6 （ 7）定量濾紙 2. 試劑 （ 1）固體硫酸銨 （ 2） 3， 5— 二硝基水揚酸顯色液：配制方法見附錄 1。 （ 3）考馬斯亮藍(lán) G250 顯色液 稱取 100mg 考馬斯亮藍(lán) G250，溶于 20mL 90%乙醇中，加入 85%（ W/V）的磷酸 100mL，最后用蒸餾水定容至 1 000mL。此溶液常溫下可放置一個月。 （ 4）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取 100mg 牛血清白蛋白，溶于 100mL 蒸餾水，即為 1 000181。g/mL 的原液。 四、操作方法 1. 取 6 只 10mL 離心管，編號。分別加入過濾后的纖維素酶粗提液 5mL，按表 1 依次加入固體硫酸銨，攪拌使其完全溶解后，靜止 10min，于 4 000r/min 離心 10min， 1 號取上清液定容到 20mL，其余各管的沉 淀用蒸餾水充分溶解并定容至 20mL，即為纖維素酶活力和蛋白質(zhì)含量測定液。 表 1 硫酸銨分級沉淀 硫酸銨加入順序 1 2 3 4 5 6 硫酸銨量（ g） 0 硫酸銨飽和度 (%) 0 30 50 70 80 90 33 剩余酶活力 (FPase/mL) 酶回收率（ %） 2. 濾紙酶活力測定：取酶液 按附錄 1 方法測定酶活力。 3. 蛋白質(zhì)含量測定 （ 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取 6 只試管，按表 2 配制牛血清白蛋白溶液各 1mL。 表 2 01 000181。g/mL 牛血清白蛋白 管號 1 2 3 4 5 6 1 000181。g/mL 牛血 清白蛋白（ mL） 0 蒸餾水（ mL） 0 蛋白質(zhì)含量（ 181。g ） 0 200 400 600 800 1 000 準(zhǔn)確吸取所配各管溶液 ，分別放入 20mL 具塞試管中，加入 5mL 考馬斯亮藍(lán) G250 試劑，蓋塞，將試管中溶液緩慢混合均勻，放置 2min 后在 595nm 波長下比色，記錄 OD 值，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （ 2）樣品測定：吸取 操作方法 1 中的 1 號和 5 號溶液 （需做一重復(fù)），放入具塞試管中，加入 5mL 考馬斯亮藍(lán) G250 試劑，蓋塞，將試管中溶液緩慢混合均勻，放置2min 后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線 1 號管作做空白，在 595nm 波長下比色，記錄光密度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。 五、結(jié)果計算 1. 以硫酸銨飽和度為橫坐標(biāo)，剩余酶活力 (U/mL)為縱坐標(biāo)繪出鹽析曲線圖。 2. 計算出 80％飽和度鹽析時酶的比活力和回收率。 六、討論 思考題： 1． 鹽析法沉淀蛋白質(zhì)的原理是什么？ 2． 硫酸銨鹽析的操作有哪些注意事項？ 34 實驗五 纖維 素酶生產(chǎn)（三） 一一 凝膠層析法純化纖維素酶 一、目的 凝膠層析又稱凝膠過濾或排阻層析，是以分子大小為基礎(chǔ)進(jìn)行物質(zhì)分離的方法。凝膠過濾的操作條件溫和，適于分離不穩(wěn)定的化合物。所用凝膠是一種不帶電荷的惰性物質(zhì)，本身不會與被分離物質(zhì)相互作用，因而溶質(zhì)的回收率接近 100%。分離效果好，重現(xiàn)性強。凝膠過濾所需儀器設(shè)備簡單，操作方便，完成一次分離所需時間較短。每個樣品洗脫完畢后，柱已再生，可反復(fù)使用。分子量大小彼此相差 25％的物質(zhì)，只要通過單一凝膠床就可以將其完全分開。樣品的用量范圍寬廣，從分析量到試驗工廠量 均適合。因此，近十幾年來，凝膠過濾已成為廣泛使用的分離、分析及制備方法。 通過本實驗了解凝膠層析的基本原理，掌握凝膠層析的一般操作技術(shù)。 二、原理 凝膠層析的主要裝置是填充有層析介質(zhì)的層析柱。層析介質(zhì)及分離原理如下： 1．層析介質(zhì)：凝膠層析以水不溶的固相凝膠作為支持介質(zhì)（也稱載體）。層析介質(zhì)應(yīng)具備下列特點：（ 1）凝膠基質(zhì)應(yīng)該是化學(xué)惰性物質(zhì)；（ 2）離子基團(tuán)含量少；（ 3）網(wǎng)眼和顆粒大小均勻；（ 4）凝膠顆粒和網(wǎng)眼大小的選擇范圍寬廣；（ 5）機(jī)械強度高。 目前使用較多的是具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠、 聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠及這些凝膠的各類衍生物。其中以葡聚糖凝膠最為常用，它具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，完全不溶于水。葡聚糖凝膠是用具有一定平均分子量的葡聚糖和環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的高分子化合物。環(huán)氧氯丙烷的作用是引進(jìn)甘油基將各個多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來。網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子量和制備時環(huán)氧氯丙烷用量來控制。多聚葡萄糖分子量越小或環(huán)氧氯丙烷用量越大，則交聯(lián)度越大，所得凝膠網(wǎng)眼越小。不同交聯(lián)度的葡聚糖用 G 值表示。 由于凝膠骨架中的多糖鏈含有大量 — OH 基，因此具有很強的親水性，能在水和電解質(zhì)溶液中膨脹。交聯(lián)度大的凝膠 網(wǎng)眼孔徑小，吸水量少，其 G 值亦小。反之， G 值增大。 G 值表示每克干膠吸水量（ mL）的 10 倍。例常用的規(guī)格有 G G1 G2G50、 G7 G100、 G150、 G200 等。實際工作中應(yīng)選用何種型號的凝膠，應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)分子的大小及工作目的來確定。 2．分離原理：選用具有一定網(wǎng)眼大小的、經(jīng)過處理的葡聚糖凝膠裝柱作為層析介質(zhì)。當(dāng)待測物質(zhì)被洗脫通過凝膠柱時，分子大小不同的物質(zhì)受到不同的阻滯作用。半徑接近或超過網(wǎng)眼半徑的分子，不進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)眼之中（這種現(xiàn)象稱為被排阻。被排阻的最小分子量稱為 該凝膠的排阻極限），受到的阻滯作用小，在重力作用下隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿著較短流程向下流動，移動速度快而先流出層析柱；而半徑小于網(wǎng)眼半徑的分子可完全滲入凝膠顆粒內(nèi)部的網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時要經(jīng)過逐層擴(kuò)散，阻滯作用大，流程長，移動速度慢，因而后流出層析柱。中等大小分子則在前二者之間按其 35 分子量大小順序流出。從而使待測樣品中的混合物被分離開來。 由于在一定的層析柱上，分子量大小不同的物質(zhì)被洗脫的時間是一定的。因此凝膠層析可用于分離、鑒定及制備。 三、主要實驗材料、儀器和試劑 1．材料：（ 1）纖維酶粗提液 ；（ 2）葡聚糖凝膠 G75（或 G50）。 2．儀器： （ 1）紫外分光光度計 （ 2）部分收集器 （ 3）真空泵，抽濾瓶，布氏漏斗 （ 4）恒流泵或恒壓瓶 （ 5）層析住： 1179。 20cm （ 6）燒杯： 500mL179。 1 （ 7）分析天平 （ 8）具塞三角瓶： 250mL 179。 l （ 9）量筒： 100mL 179。 1 （ 10）離心機(jī)，離心管 （ 11）移液管： ， ， mL， 1mL， 2mL， 5mL， 10mL。 （ 12）透析袋 3．試劑： （ 1） (NH4)2SO4 （ 2）洗脫液 ： 。 四、操作方法 1. 溶脹凝膠： 稱取交聯(lián)葡聚糖凝膠 G— 75 5g 或適量（視層析柱容積而定），加入 500mL 蒸餾水于沸水浴中溶脹 5h。待溶脹平衡后，用虹吸法除去含有細(xì)顆粒的上層液。然后再放些蒸餾水用玻棒攪拌〕稍靜置，待大部分凝膠沉降后，再虹吸除去含有細(xì)顆粒凝膠的上層液，如此反復(fù)操作多次，至無細(xì)顆粒為止。最后將漂洗好的凝膠在真空干燥器中減壓除氣，準(zhǔn)備裝柱。 2. 裝柱： 取帶有燒結(jié)玻璃瓷芯的層析柱 1 支。左手倒持層析柱，使下口朝上。在出口內(nèi)插一根毛細(xì)管。然 后用洗瓶從出口向內(nèi)注入蒸餾水，瓷芯下方氣泡即從毛細(xì)管中排出。此時迅速翻轉(zhuǎn)層析柱，用洗瓶從上口向柱內(nèi)急速注水。將柱子垂直固定在鐵架臺上。在水流不斷的情況下，在下口上連接帶有滴嘴的乳膠管。為避免氣泡沿下口竄入。滴嘴應(yīng)向上翹，讓水流排走氣泡。接好乳膠管，夾上螺旋止水夾。往內(nèi)應(yīng)保存有 3～ 5cm 水層。在瓷芯上鋪一塊 400 目圓形尼龍網(wǎng)。 將處理好的凝膠用玻棒攪勻。打開螺旋夾，用一燒杯承接流水。沿玻棒勻速倒入凝膠漿。凝膠逐漸沉降。當(dāng)膠床表面僅有 2cm 液層時，旋緊螺旋夾。床面上蓋一塊圓型濾紙片，以防不溶物侵人床面和防止 液滴對床面的沖擊。用管道連接下口與部分收集器 36 滴頭，即可投入使用。 3. 纖維素酶初步純化： 取 50mL 纖維素酶發(fā)酵液，經(jīng) 35%和 80%飽和度硫酸銨分級沉淀，將沉淀裝入透析袋中，在水中透析 24h 除鹽和色素， 12h 換一次水（如有沉淀需用離心法除去沉淀， 4 000r/min， 5min），一般需要透析 48h；也可用 510mL ， 檸檬酸綬沖液直接溶解分級沉淀物，得到層析分離粗酶液。 4. 上樣： 上樣前 Sephadex G75 柱應(yīng)預(yù)先用 ， 檸檬酸綬沖液平衡 2～ 3h，上樣時膠床表面只留約 1mm 液層。然后用吸管吸取 ～ 樣品提取液，小心注入層析柱床面中央（勿沖動膠床?。?。開啟收集器，打開螺旋夾開始收集并計算體積。待大部分樣液已進(jìn)入膠床，床面上僅有 1mm 左右液層時，再用膠頭滴管加入洗脫液，使液層達(dá)到 3cm 左右，戴上柱帽。（注意不要讓液滴直接沖擊膠面） 5. 洗脫、收集： 洗脫液為 ， 檸檬酸綬沖液。 管路連接好后，打開恒流泵輸液，調(diào)整流速，使流速保持 510 滴 /分（每滴 612 秒），進(jìn)行洗脫。 本實驗以計時收集，每 2mL 左右收集 一管。 五、結(jié)果計算 1. 在記錄儀上記下每管蛋白質(zhì)吸收曲線和管號。 2. 對有吸收峰的管要測定出纖維素酶活性，對照蛋白質(zhì)吸收曲線繪出酶活性曲線，確定哪些管中有纖維素酶，收集合并含酶試管中的溶液。 3. 計算纖維素酶比活力和回收率。 六、討論 思考題： 1. 凝膠層析法分離生物大分子的原理是什么？ 2. 哪些因素影響凝膠層析分離？ 37 實驗六 纖維素酶在加工蔬菜汁中的應(yīng)用 一、目的 1. 掌握纖維素酶加工制備蔬菜汁、果汁等的基本方法。 2. 了解酶制劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。 二、原 理 在蔬菜汁的生產(chǎn)工藝中，榨汁工藝的好壞直接影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。傳統(tǒng)的單純機(jī)械榨汁往往是出汁率不高，加熱蒸煮或用酸堿處理雖可使組