【正文】 置，待血液凝固后，即有血清析出；冬季，因室溫較低，室溫下放置時血液凝固緩慢，不易析出血清，故需將血液置于37℃水浴或溫箱中促進血清析出。血清析出后，用吸管吸取上層血清置于另一試管，若不清亮或帶有血細胞，應(yīng)離心，將上清移于另一試管中，加蓋冷藏備用。二、免疫球蛋白的提取原理 IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，分子量約為15萬~16萬，沉降系數(shù)約為7s。IgG是動物和人體血漿的重要成分之一。血漿蛋白質(zhì)的成分多達70余種，要從血漿中分離出IgG，首先要進行盡可能除去其他蛋白質(zhì)成分的粗分離程序，使IgG在樣品中比例大為增高，然后再純化而獲得IgG。鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”。而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時，蛋白質(zhì)又變得不溶而自動析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析”。由于各種蛋白質(zhì)分子所帶的電荷數(shù)目不同，它們在蛋白質(zhì)表面上分布情況也不一樣，因此將不同蛋白質(zhì)“鹽析”出來所需的鹽濃度也各異，鹽析所需的最小鹽量稱為鹽析濃度。鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合溶液中的各個成分分步“鹽析”出來，達到分離目的蛋白質(zhì)。鹽析法所使用的鹽有硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽，其中運用最廣的是硫酸銨。因為硫酸銨有許多其他鹽所不具備的優(yōu)點，如在水中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；溶解度大，25℃；溶解度的溫度系數(shù)變化小，在0～30℃范圍內(nèi)溶解度變化不大，如，25℃，即767g/L，0℃ mol/L，即676 g/L。而且硫酸銨廉價易得，分段效果比其他鹽好，性質(zhì)溫和，即使?jié)舛群芨邥r也不會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。因此，現(xiàn)在所指的鹽析法實際上多為硫酸銨鹽析法。用硫酸銨分級鹽析蛋白質(zhì)時，鹽析出某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨濃度一般以飽和度來表示。實際工作中將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100％或1。鹽析某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨數(shù)量折算成100％或1飽和度的百分之幾，即稱為該蛋白鹽析的飽和度。飽和度可以根據(jù)情況用下述兩種方法計算。飽和硫酸銨溶液法 在蛋白質(zhì)溶液的總體積不大，要求達到的飽和度在50%以下時，可選用此方法。在已知鹽析出某種蛋白質(zhì)成分所要達到的飽和度時，可按下列公式計算出應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的量：V=V0（C2C1）/(100C2) 或V=V0（C2C1）/(1C2)式中 V0—蛋白質(zhì)溶液的原始體積； C2—所要達到的硫酸銨飽和度； C1—原來溶液的硫酸銨飽和度； V—應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的體積。將計算所得體積的飽和硫酸銨溶液加入到混合蛋白質(zhì)溶液中，即可達到鹽析的目的。嚴(yán)格講，混合兩種不同溶液時，混合后的總體積并不等于前兩種體積之和，而上式中按相等于計算的，所以會產(chǎn)生誤差。但試驗證明所造成的誤差一般小于20％，故可忽略不計。試劑與器材（1） 飽和硫酸銨溶液：取化學(xué)純（NH4）2SO4800g,加蒸餾水1000ml，不斷攪拌下加熱至5060℃，并保持?jǐn)?shù)分鐘，趁熱過濾，濾液在室溫中過夜，又結(jié)晶析出，即達到100％飽和度。（2） ，磷酸鹽緩沖溶液： mol/L mol/L ，混合。取該混合液50ml，用蒸餾水稀釋至1000ml。（3） mol/L，磷酸鹽緩沖溶液： mol/L mol/L 。，用蒸餾水稀釋至1000ml。操作（1） mol/L，混習(xí)。用皮頭滴管吸取飽和硫酸銨溶液，邊滴加邊攪拌于血漿溶液中，使溶液的最終飽和度為20％（應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液多少毫升？），用滴管邊加邊攪拌，是為防止飽和硫酸銨溶液1次性加入和攪拌不均勻造成局部過飽和的現(xiàn)象，使鹽析達不到預(yù)期的飽和度，得不到目的的蛋白質(zhì)。攪拌時不要過急以免產(chǎn)生過多泡沫，致使蛋白質(zhì)變性。加完后應(yīng)在4℃放置15min，使之充分鹽析（蛋白質(zhì)樣品量大時，應(yīng)放置過夜）。然后以3000r/min離心10min。棄去沉淀（沉淀為纖維蛋白質(zhì)），在上清液中為清蛋白、球蛋白。（2） 量取上清液的體積，置于另一離心管中，用滴管繼續(xù)在上清液中滴加飽和硫酸銨溶液，使溶液的飽和度達到50％（應(yīng)加飽和硫酸銨溶液多少毫升？）。加完后在4℃放置15min，以3000r/min離心10min，清蛋白在上清液中，沉淀為球蛋白。棄去上清液，留下沉淀部分。（3） 。滴加飽和硫酸銨溶液，使溶液的飽和度達到35（應(yīng)加飽和硫酸銨溶液多少毫升？）。加完后4℃放置20min，以3000r/min離心15min，α，β球蛋白在上清液中，沉淀為IgG。棄去上清液，棄獲得粗制的IgG沉淀。為了進一步純化，操作(3)可重12次。 mol/L。三、IgG的脫鹽原理 凡鹽析產(chǎn)品所獲得的粗蛋白質(zhì)中均含有硫酸銨等鹽類，這些將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽”。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法。前者透析后樣品的終體積較小，所需時間較長，鹽不易除盡。常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G25或G50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。試劑與器材(1)奈氏（Nessler）試劑：于500ml錐形瓶內(nèi)加入碘化鉀150g，碘110g，汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7－15分鐘，至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時，混合液溫度升高，將此瓶侵入冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩，直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色的碘化鉀汞液為止。將上清液2000ml量筒內(nèi)，加蒸餾水至2000ml，混均備用。應(yīng)用時取母液150ml，加10％氫氧化鈉溶液700ml。蒸餾水150ml，混均即可。若發(fā)生混濁，可靜置1日，取上清液使用。（2）20％（W/V）磺基水楊酸溶液（3）白比色磁盤。操作（1）透析袋準(zhǔn)備：商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為23 mm～50 mm不等。為防干裂，出廠時都用10％的甘油處理過，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，它們對蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害，用前必須除去。可先用50％乙醇煮沸1小時，再依次用50％乙醇、 mol/ mol/L EDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。實驗證明，50％乙醇處理對除去具有紫外吸收的雜質(zhì)特別有效。使用后的透析袋洗凈后可存于4℃蒸餾水中，若長時間不用，可加少量NaN2，以防長菌。洗凈涼干的透析袋彎折時易裂口，用時必須仔細檢查，不漏時方可重復(fù)使用。 新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈，即可使用。使用時，一端用橡皮筋或線繩扎緊，也可以使用特制的透析袋夾夾緊，由另一端灌滿水，用手指稍加壓，檢查不漏，方可裝入待透析液，通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時，袋外的水和緩沖液過量進入袋內(nèi)將袋漲破。含鹽量很高的蛋白質(zhì)溶液透析過夜時，體積增加50％是正常的。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。小量體積溶液的透析，可在袋內(nèi)放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。在上面制備得到的蛋白沉淀中，加水3ml，用小玻璃棒攪起（觀察沉淀是否溶解）。裝入透析袋，置于盛有50ml水的小燒杯中，使袋內(nèi)外的液面處于同一水面上，透析15分鐘，此時可使鹽類通過半透膜進入水中。以后時間間隔延長為30分鐘，1小時等。檢查是否透析干凈 取白色比色磁盤，加入燒杯溶液1滴，再加入Nessler試劑1滴，搖勻。有黃色或黃褐色沉淀生成，表示有銨鹽存在。繼續(xù)透析直到檢查無色為止。四、冰凍干燥 冰凍干燥機是生化與分子生物學(xué)實驗室必備的儀器之一，因為大多數(shù)生物大分子分離純化后的最終產(chǎn)品多數(shù)是水溶液，要從水溶液中得到固體產(chǎn)品，最好的辦法就是冰凍干燥，因為生物大分子容易失活，通常不能使用加熱蒸發(fā)濃縮的方法。 冰凍干燥是先將生物大分子的水溶液冰凍，然后在低溫和高真空下使冰升華，留下固體干粉。操作：將透析后的樣品放入培養(yǎng)皿中，液層不要太厚，以免凍干時間太長，耗電太多。凍干后稱重計算得率。18