免疫共沉淀步驟-資料下載頁
2025-06-24 22:34本頁面
【正文】 ，這時候會對IP結(jié)果影響很大。用抗體做內(nèi)源性IP時，個人喜歡抗體2hr+beads 1hr，抗體孵育可過夜；beads不超過3hrs（含flag等等標(biāo)簽蛋白IP情況）。這里面提到一個細(xì)節(jié)，就是先加beads還是先加抗體。在某些情況下，CE離心去除細(xì)胞碎片后的上清是一個剛好的溶解平衡體系，添加其他物質(zhì)如beads這類可作為沉淀凝結(jié)核的物質(zhì)會破壞原本的溶解平衡；它可能類似水蒸氣凝結(jié)成雨水或雪花需要灰塵作為凝結(jié)核，其結(jié)果就是讓一些原本溶解完全的蛋白發(fā)生沉淀。那么，beads翻轉(zhuǎn)越久蛋白會沉淀越多，而這種沉淀無法靠漂洗去除干凈，最終進(jìn)入sample從而可以檢測到任意蛋白的結(jié)合。因此，限制beads翻轉(zhuǎn)孵育時間非常關(guān)鍵；通常beads孵育12hr已經(jīng)充分結(jié)合了。做IP的beads其物理性質(zhì)跟吸附DNA的或諸如NiNTA之類的差異很大，不需要高速離心，通常臺式小離心機(jī)45K、30sec就足夠了；有時候忘記了，靜置較久beads已自然沉降甚至不需要離心。在這種情況下，不必要的高速離心只會給beads施加巨大的離心力，次數(shù)多了beads通通碎裂，嚴(yán)重影響再生beads的質(zhì)量——避免一些不必要的操作；當(dāng)然不打算重復(fù)使用就無所謂了。Beads再生：商品化的beads尤其抗體交聯(lián)的，因?yàn)榭贵w和專利的原因價格相對昂貴，那么回收beads并再生就顯得非常必要。保管得好（防霉變），beads可以重復(fù)用2030次。再生beads沒有什么特別的，常做生化柱層析的，那簡直就是家常便飯。IP用beads的再生，也無非就是高鹽接酸洗再高鹽，最后用IP漂洗buffer復(fù)性，加甘油和NaN3扔20度長期保存。高鹽即3M NaCl；酸洗，就是可用做elution 。IP beads尤其抗體交聯(lián)的，由于昂貴再加實(shí)驗(yàn)和回收過程的損失一般體積不大，所以Biorad公司一種小型塑料的柱層析管用來再生beads最合適（它是一次性的，但僅僅用于再生beads可以無限重復(fù)使用）；而常規(guī)的玻璃生化層析柱即便最小號的也太大，黏壁損失會很大，beads再生幾次可能就全損失了。再生操作就類似做DNA大抽的KIT，加液體到層析柱、控制流速讓其一滴滴流下；再生質(zhì)量可以通過改變酸、鹽的體積控制，希望干凈點(diǎn)多加一些、多洗幾遍。唯一需要注意的，由于再生流程通常要耗費(fèi)半天時間，beads太少不值得操作且再生次數(shù)越多黏壁損失也越多；所以，通常都是等回收的舊beads積攢到一定體積再一次性操作。前文提過，IP用的beads通常不需要離心就會自然沉降，而積攢舊beads通常是一個很漫長的過程，那么等到?jīng)Q定再生的時候，beads可能因?yàn)殪o置過久而已經(jīng)壓擠得非常結(jié)實(shí)；直接重懸beads轉(zhuǎn)移到層析柱里，你會發(fā)現(xiàn)液體根本流不下來。因此，對于靜置很久的舊beads通常在回收前一天高速翻轉(zhuǎn)過夜，這時候再把beads轉(zhuǎn)移到層析柱中就會相對疏松，酸、鹽洗滌就會比較流暢。同樣的原因，再生過程中通常就是流速越來越慢，再生次數(shù)多的舊beads其內(nèi)含的灰塵、顆粒也較多，可能最后液體就不滴了；這時候只能用槍反復(fù)吹吸、松松beads。當(dāng)然，這些問題都只在beads體積較大的時候時明顯，如果本來就不足1ml，以上就全是廢話。PS:此篇更新會相當(dāng)慢，盡量不太監(jiān)，請見諒——先留個爪有感于壇友對本文的關(guān)注：【近況】：非常抱歉最近一直沒更新，原因主要有二。1. 思路中斷。這篇要全新寫，通盤的概念是有的，但對于每個細(xì)節(jié)以及內(nèi)容的銜接很模糊，很難下筆；因?yàn)榧词姑銖?qiáng)著述，按個人行文的習(xí)慣，前后修改等于重寫，時間需要很久。2. 最近忙于結(jié)尾自己的手頭課題，拼盡全力追求進(jìn)度，連續(xù)多日工作1416小時以上，身體已多次出現(xiàn)過勞體征；還要應(yīng)付研究以外的工作，實(shí)在無暇顧及這邊。目前，我優(yōu)先保證問題的回復(fù)。exciting news: paper accepted!BTW:個人還是喜歡先回復(fù)再寫一個總結(jié)，因?yàn)榻佑|到的問題會比較全面，諸如最近好幾個人提問時，給出了詳細(xì)的流程，這很好；可是當(dāng)我看到第一步，就知道下面不用細(xì)看了?？赡芎芏嗳硕枷矚g在刀尖上跳舞玩心跳，不過我個人還是喜歡穩(wěn)穩(wěn)當(dāng)當(dāng)先有結(jié)果再來跳舞——為什么很多人起始細(xì)胞量只有6孔板、60mm dish，大家都喜歡這么虐待自己嘛——讓心靈承受一次次實(shí)驗(yàn)無信號的打擊?。浚。浚。恳虼?，我也知道在制備CE那一部分需要補(bǔ)充強(qiáng)調(diào)的東
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