高級生物化學(xué)復(fù)習(xí)資料-資料下載頁
2025-06-08 00:18本頁面
【正文】 的人胰島素mRNA，試設(shè)計兩個試驗隊一個克隆基因片段進(jìn)行鑒定，你是否確定它是胰島素基因？答：試驗一：設(shè)計polyT引物，用P32標(biāo)記的dNTD為原料，對人胰島素進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得人胰島素cDNA，然后以cDNA為探針與克隆基因片段進(jìn)行Southen雜交，若克隆基因片段能與cDNA互補(bǔ)雜交，說明其克隆基因是胰島素基因。 試驗二：將克隆基因片段通過合適的載體導(dǎo)入到受體菌中，使克隆基因在受體中表達(dá)得到蛋白質(zhì)產(chǎn)物，然后以人胰島素mRNA為模板得到與mRNA互補(bǔ)的反義RNA，將反義RNA導(dǎo)入受體菌中，若受體菌中不再出現(xiàn)克隆基因的產(chǎn)物，說明反義RNA與克隆基因的mRNA互補(bǔ)阻斷了基因表達(dá)，則可證明克隆基因是胰島素基因。2. 有一種蛋白質(zhì)，在某組織內(nèi)含量較低，很難分離純化，現(xiàn)以知其分子量，并有其抗體，問用哪些實驗方法可初步證實該組織內(nèi)確實有該蛋白質(zhì)？答：將該組織的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離出一系列相對分子量不同的蛋白質(zhì)電泳條帶，將與其分子量相對應(yīng)的蛋白質(zhì)帶分離出并印記在硝酸纖維膜上，再用帶標(biāo)記的抗體與之進(jìn)行反應(yīng)，若出現(xiàn)陽性結(jié)果，則說明該組織內(nèi)的確含有該蛋白質(zhì)。信號分子→受體/GC→cGMP→蛋白激酶G→效應(yīng)蛋白/酶→生理效應(yīng)，操縱基因，啟動基因，調(diào)節(jié)基因。能利用乳糖是由于乳糖與阻遏蛋白結(jié)合。發(fā)現(xiàn)沒有乳糖而大量產(chǎn)生β半乳糖苷酶的變異株，這是由于調(diào)節(jié)基因的突變，而不能產(chǎn)生阻遏物或者由于操縱基因的突變，阻遏蛋白不能和操縱基因結(jié)合，所以沒有乳糖時結(jié)構(gòu)基因也可以活動，它的遺傳信息傳遞給mRNA，最后在核糖體上合成β半乳糖苷酶。，預(yù)測以下變化對色氨酸操縱子的影響。①刪除整個前導(dǎo)區(qū)域。答：弱化作用消失，轉(zhuǎn)錄只是單純有阻遏物調(diào)控，而色氨酸阻遏調(diào)控很弱，因此轉(zhuǎn)錄的總速度是增加的。②刪除編碼前導(dǎo)肽的序列。答：轉(zhuǎn)錄只由阻遏物調(diào)控，沒有片段1的行程，從而形成2,3莖環(huán)結(jié)構(gòu)，阻止了3,4莖環(huán)的形成，即無衰減作用。對已啟動的色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄將繼續(xù)進(jìn)行。③前導(dǎo)區(qū)域不含AUG密碼子。答：色氨酸操縱子難以啟動轉(zhuǎn)錄，缺乏起始密碼，前導(dǎo)肽的合成不會發(fā)生，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。，當(dāng)細(xì)菌在以下物質(zhì)條件存在下生長時，乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄速度如何？（1）乳糖與葡萄糖同時存在（2）葡萄糖存在時（3）只有乳糖時。答：（1）乳糖與阻遏物結(jié)合，使阻遏物不能與操縱子基因結(jié)合，使操縱基因處于開放狀態(tài)。但葡萄糖存在時，細(xì)胞中cAMP濃度處于很低水平，不能與ACP結(jié)合形成cAMP—ACP復(fù)合物，不能與啟動子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，故結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)或低水平表達(dá)，所以轉(zhuǎn)錄處于很低水平。（2）葡萄糖存在時，細(xì)胞中cAMP濃度處于很低水平，不能與ACP結(jié)合形成cAMP—ACP復(fù)合物，不能與啟動子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，而且無乳糖與阻遏物蛋白結(jié)合，阻遏蛋白結(jié)合在操縱基因上，也阻斷了轉(zhuǎn)錄的表達(dá)。所以乳糖操縱子不轉(zhuǎn)錄。（3）乳糖與阻遏物結(jié)合，使阻遏物不能與操縱子基因結(jié)合，使操縱基因處于開放狀態(tài)。同時cAMP濃度很高，與CAP結(jié)合形成復(fù)合物，cAMP—ACP復(fù)合物與啟動子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。所以乳糖操縱子處于高水平的轉(zhuǎn)錄速度。，為了分離它所表達(dá)的一個外源基因的產(chǎn)物并保持它的活性，為了某種目的，根據(jù)下列要求寫出具體要求（1）利用溶解度差異進(jìn)行分離：鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀（2）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離：透析和超濾，凝膠過濾，密度梯度離心。（3）根據(jù)不同的電荷進(jìn)行分離：電泳，離子交換層析。（4）已制備有該產(chǎn)物的抗體進(jìn)行分離：親和層析。（5）產(chǎn)物濃縮：蒸發(fā)濃縮，吸收濃縮。（6）產(chǎn)物濃度的鑒定：層析法，電泳法，沉降分析法。：非極性氨基酸，酸性氨基酸，堿性氨基酸，非解離的極性氨基酸。，結(jié)合酶。：脂類，蛋白質(zhì)。：NO合酶通過氧化L精氨酸的胍基而產(chǎn)生NO。：膜受體，胞內(nèi)受體。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)換信號的方式前者又分為三大類：離子通道受體，G蛋白偶聯(lián)受體，具有酶活性的受體。①外源編碼基因要完整，沒有插入序列，一般用mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。②為保證真核基因產(chǎn)物在菌中的穩(wěn)定，通常將真核基因克隆序列到原核某個基因中。③許多蛋白質(zhì)或多肽與5’端往往含有一段信號肽基因，在克隆基因中保留信號肽序列，有利于表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)菌分化到溶液中，有利于產(chǎn)物的分離純化。：DNA的均一性，GC的含量，介質(zhì)離子強(qiáng)度。：氫鍵，離子鍵，范德華力，二硫鍵，配位鍵，疏水作用力。：有機(jī)磷化合物，有機(jī)汞，砷化合物，重金屬鹽，烷化試劑，氰化物，CO。：高度的親和力，高度的特異性，可逆性，可飽和性，可調(diào)節(jié)性。，應(yīng)至少滿足哪些條件。答：要構(gòu)造一個合適的表達(dá)載體。通常原核表達(dá)載體要求有一個強(qiáng)的原核啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；要有SD序列，及SD序列與起始密碼子之間要有合適的距離，在克隆基因與啟動子之間有正確的可讀框；外源基因下游加入不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)。
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