【正文】 除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。3. 驗(yàn)證的實(shí)施 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證記錄及控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證記錄（見附錄）。，綜合整個(gè)驗(yàn)證過程，得出驗(yàn)證結(jié)論。 驗(yàn)證過程中發(fā)生的異常情況，按照《偏差處理程序》進(jìn)行處理。4. 在驗(yàn)證 驗(yàn)證時(shí)的檢驗(yàn)條件愛你發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。5. 附錄《微生物限度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證。通過驗(yàn)證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測(cè)定 。項(xiàng)目責(zé)任人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草及具體實(shí)施。驗(yàn)證管理員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。QA現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證實(shí)施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。QC負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案中檢驗(yàn)方法的審核及按照規(guī)定的取樣計(jì)劃對(duì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行，負(fù)責(zé)組織實(shí)施。QC檢驗(yàn)員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草與參與實(shí)施，并對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的審核和批準(zhǔn)。通過驗(yàn)證以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測(cè)定；確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，按驗(yàn)證的方法和條件進(jìn)行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測(cè)定。.驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。 大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至106~107，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)；%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至106~107，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml %無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至104~106，制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。. 供試液的制備◆稀釋劑：◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）?！艄腆w、半固體、粘稠性供試品供試品： 稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，須先消除抑菌活性，其方法如下：◆培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，；，傾注15ml的培養(yǎng)基，測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)可加大增菌液的用量?！綦x心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量?！舯∧み^濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測(cè)定其菌落數(shù)?！糁泻头ǎ哼x取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶?duì)氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測(cè)定。. 菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。采用平皿法，取試驗(yàn)用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。（平皿法）：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液分別注入N個(gè)平皿中，每個(gè)平皿再注入50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測(cè)定其菌落數(shù)。至少要一張膜。：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計(jì)數(shù)。. 供試品對(duì)照組取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗(yàn)組相同）。若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)。試驗(yàn)組的菌回收率＝試驗(yàn)組的菌回收率—供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)100%菌液組的平均菌落數(shù). 稀釋劑對(duì)照組回收率計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率＝稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)100%菌液組的平均菌落數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證，使試驗(yàn)組菌回收率大于70%。. 控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測(cè)定。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至105~107，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。 設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。 ◆大腸埃希菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。◆大腸菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml 、陽性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項(xiàng)下規(guī)定檢查。 ◆沙門菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對(duì)照加入沙門菌 10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。 ◆銅綠假單胞菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對(duì)照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。 ◆金黃色葡萄球菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強(qiáng)的樣品。. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。 在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對(duì)微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對(duì)微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證記錄及控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證記錄(見附件)。，綜合整個(gè)驗(yàn)證過程，得出驗(yàn)證結(jié)論。，按照《偏差處理程序》進(jìn)行處理?！段⑸锵薅葯z查SOP》 。藥品微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案 方 案 審 批1方案起草起草部門簽名日 期質(zhì)量控制部 年 月 日2方案會(huì)簽部 門簽 名日 期QC部長 年 月 日微生物檢驗(yàn)員 年 月 日 QA部長 年 月 日3方案批準(zhǔn)批 準(zhǔn) 人簽 名日 期質(zhì)量負(fù)責(zé)人 年 月 日4方案實(shí)施實(shí)施部門職 責(zé)質(zhì)量控制部對(duì)驗(yàn)證工作與檢驗(yàn)相關(guān)的數(shù)據(jù)的采集與檢驗(yàn)驗(yàn)證方案、報(bào)告的編寫質(zhì)量保證部負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案和報(bào)告的審核對(duì)人員進(jìn)行培訓(xùn)文件進(jìn)行整理歸檔質(zhì)量負(fù)責(zé)人對(duì)驗(yàn)證工作全面主持批準(zhǔn)驗(yàn)證方案和報(bào)告微生物檢驗(yàn)員方案具體實(shí)施，并出具檢驗(yàn)記錄和報(bào)告 目 錄1. 概述2. 儀器設(shè)備3. 供試液的制備4. 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)5. 控制菌檢查6. 驗(yàn)證品種項(xiàng)目表微生物限度檢查法概述微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢查全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為30～35℃，真菌、酵母菌的培養(yǎng)溫度為25～28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為（36177。1）℃。檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告以1g、1ml、10g、10ml為單位報(bào)告。檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的三倍量供試品。2 儀器設(shè)備 YXQLS30SII型立式壓力蒸汽滅菌器 雙人凈化工作臺(tái) 150A型培養(yǎng)箱 2022型干燥箱 微波爐 架盤天平 YJA電動(dòng)勻漿儀3 供試液的制備根據(jù)供試品的理化特征與生物學(xué)特征，可采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需要用水浴加熱時(shí)，溫