【正文】 立腦出血模型是目前國內(nèi)外使用最多的兩種腦出血模型。但自體血注入法在取血過程中需控制在 3min內(nèi)完成 ,否則血液凝固；注血過程中血液大多從進針處冒出 ,血腫大小很不穩(wěn)定；神經(jīng)功能損傷不明， Bederson評分一般在 2分左右。但血腫周圍水腫帶比較明顯 ,因此該模型可用于腦水腫的機制、藥物療效及其作用機制的研究。膠原酶注入法 :由膠原酶誘導的大鼠尾狀核腦出血模型所產(chǎn)生的腦出血以滲出為主 ,出血量大 ,產(chǎn)生的血腫大小基本一致 ,并且神經(jīng)功能障礙比較明顯 ,Bederson評多在4分左右，是 比較常用的疾病動物模型 ? 肝纖維化模型 1. 造模因素： (1)化學毒物：如 CCl DMN； (2)生物因素：血吸蟲尾蚴、細菌細胞壁、異種血清、異種動物蛋白、刀豆球蛋白 (concanavalin A)； (3)機械因素：如結扎膽管 2. 指標 (1) 生物化學指標，如肝 hydroxyproline (2) 組織形態(tài)學指標，如肝組織切片 HE染色、膠原染色、免疫組化 (3) 血清學指標，如 HA, PIIIP,IV Col,LN (4) 細胞學及分子生物學指標 (5) 各種反映模型產(chǎn)生與藥物作用機制的指標 第 5節(jié) 新方法簡介 轉基因動物 (transgenic animal) ? 沒有新的篩選模型，就沒有新型藥物 ? 轉基因動物 指體內(nèi)基因組中穩(wěn)定地整合有外源性基因的動物，轉基因動物技術的發(fā)展，使人為對動物基因組進行遺傳修飾成為可能 ? 轉基因動物 的一種較為嚴謹?shù)母拍钍牵骸?外源 DNA” 導入 (包括同一物種的 DNA)動物的基因組而產(chǎn)生了可以遺傳的改變 ? 轉基因動物就是把 外源性目的基因 導入動物的受精卵或其囊胚細胞中；然后注入受精卵的任何一個前核，并在細胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細胞篩選出來；采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動物（ foster mother）的子宮內(nèi) , 使之發(fā)育成能表達目的基因的胚胎動物 , 并能傳給下一代。這樣，生育的動物為轉基因動物。這類動物由于外源性目的基因的穩(wěn)定存在而賦于子代動物個體 ? 這些可以遺傳的改變包括： ?外源 DNA片段至少整合到一條染色體的一個位點上 ?外源 DNA的插入使基因組中任何一個基因的結構發(fā)生改變 ?外源 DNA的插入使染色體發(fā)生重排 ?導入可以持久存在的遺傳實體，如一條人工染色體或者可以自我復制并傳遞給子細胞的非染色體 DNA元件 ? 不屬于轉基因動物范疇的其它手段 ： ?由于化學品的誘變作用導致基因發(fā)生改變 ?由于輻射作用導致基因發(fā)生改變 ?由于化學品或輻射的作用使染色體發(fā)生畸變 ?通過核移植交換遺傳物質(zhì) ?使用基因治療技術導入 DNA ? 轉基因動物在基礎生物學研究和醫(yī)學及農(nóng)業(yè)應用研究上有其獨特作用，不可能被其它方法所取代 ? 研究基因的功能和基因間互作，最有效的手段是基因剔除技術和把人工修飾后的基因序列定向地整合到它原來的基因座上 ? 基因定向整合只能在細胞中完成，經(jīng)過基因修飾的細胞需要變成動物，只有在活的動物體才能觀察和檢驗基因的功能 ? “ 多莉 ” 技術表明：動物體上多種類型的體細胞都可以通過克隆變成動物個體，再沒必要研究胚胎干細胞， 體細胞培養(yǎng) 條件比胚胎干細胞簡單很多 ? 體細胞核移植 技術為基因結構、功能和表達調(diào)控的研究提供了飛速發(fā)展的基本條件 ? 體細胞克隆 技術的出現(xiàn)，使我們可以能動地改進動物的基因組，應用基因工程的手段培育動物優(yōu)良品種 ? 使用 基因定向轉移 技術，在基因座上對基因的結構部分和調(diào)控部分進行修改，并把這種經(jīng)過基因修改的細胞變成動物個體 ? 獲得理想的基因修飾的細胞可以大量繁殖，并使用它們克隆出一批動物 ? 在基因座上對基因進行修改相當于一種自然發(fā)生的有利突變，并可成批生產(chǎn) ? 基因定向轉移和體細胞克隆，是生命科學中兩項重大技術，二者結合就獲得了按照事先的設計，有計劃地修改動物基因組的能力 ? 轉基因小鼠技術 ?廣義的轉基因小鼠技術是指將外源基因?qū)氲叫∈蠼M織細胞內(nèi)，并發(fā)揮作用的過程 ?將外源基因?qū)氲叫∈篌w內(nèi)，并且導入的基因可以通過遺傳傳給子代 (將 SV40病毒的 DNA注射到小鼠囊胚腔中；小鼠受精卵原核 DNA顯微注射 ) ?明確了 2個概念：導入的基因可以在小鼠體內(nèi)表達并發(fā)揮作用；人類的基因同樣可以在小鼠體內(nèi)發(fā)揮與原來相同或相似的作用 ?應用或意義：研究導入基因表達產(chǎn)物的體內(nèi)功能；建立疾病動物模型；進行基因表達調(diào)控的研究如特定基因表達的時空特性；結合反義技術和 RNAi技術，用于專一性抑制小鼠體內(nèi)特定基因表達 ?轉基因小鼠實驗內(nèi)容：導入基因表達載體的構建；轉基因小鼠的建立和鑒定；轉基因小鼠品系的繁復；表型鑒定 ? 小鼠的基因剔除技術 指利用細胞內(nèi)染色體 DNA可以與導入細胞的外源 DNA在相同序列的區(qū)域內(nèi)發(fā)生同源重組的現(xiàn)象，在小鼠胚胎干細胞 (ES細胞 )中定點破壞內(nèi)源的基因，而后利用 ES細胞發(fā)育的全能性，獲得從 ES細胞發(fā)育而來的帶有預定基因缺陷的雜合子小鼠，通過遺傳育種最后獲得目的基因純合缺陷的小鼠個體 ?1981年 Evans和 Martin等利用小鼠胚胎內(nèi)細胞團建立的體外可以連續(xù)擴增和傳代的具有發(fā)育全能性的胚胎干細胞即 ES細胞 ?Robertson等對 ES細胞進行轉基因操作，并獲得ES細胞來源的小鼠個體 ?1988年 Thomas等在 ES細胞中利用 DNA同源重組的原理實現(xiàn)了對預定基因進行缺失突變 (基因打靶 )，基因剔除技術正式建立 ?1993年 Gu等將 CreLoxP系統(tǒng)用于 ES細胞的打靶，建立了條件性基因剔除和基因敲入 (gene knockin)技術 ? 建立一個基因剔除小鼠的步驟： ?基因打靶載體的構建 ?ES細胞的 DNA轉染和基因剔除陽性細胞克隆的篩選 ?ES細胞的囊胚注射和胚胎移植 ?嵌合小鼠及基因剔除雜合子小鼠的獲得 ?純合小鼠的獲得及表型研究 ? 制備免疫缺陷型動物模型，用于免疫性疾病及抗腫瘤和抗感染的藥物研究 ? 制備各種與人類相應遺傳病具有最接近的 遺傳改變的轉基因小鼠 ，并運用基因敲除 (geneknockout)技術完全排除其他基因影響，精確檢測遺傳改變所導致的結果，研究致病基因的功能，闡明結構、功能及在染色體上的定位 ? 利用 基因工程方法將致病基因?qū)肱咛?，誘發(fā)帶有特殊病種的動物模型，如將乙肝病毒核酸基因?qū)胄∈笊臣毎?，得到篩選抗肝炎的藥物模型 ? 轉基因大動物 提供了一種生產(chǎn)特殊藥物的 生物工廠 (biofactories)，即在轉基因動物的乳汁中生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)，如能分泌 α1 抗胰蛋白酶 (ATT)的轉基因綿羊；可分泌人 tpA的轉基因山羊；如抗凝血酶 Ⅲ ，磷脂蛋白、血紅蛋白、生長激素等 ? 轉基因動物具有外源基因局限于乳腺表達 ，受整個動物體影響少；乳腺可對蛋白質(zhì)進行復雜的翻譯后加工，類似人體產(chǎn)品，天然活性較高；乳汁蛋白純化技術簡單，無污染 ? 基因工程技術使人類能定向改造生物，創(chuàng)造新產(chǎn)品，生產(chǎn)原先難于獲得的大量產(chǎn)品或更有效地生產(chǎn)現(xiàn)有產(chǎn)品。已有近 30種基因工程藥物投入市場，以 DNA重組技術為基礎的生物技術成果主要集中在 蛋白質(zhì)類 、 多肽類 和 基因工程疫苗 ?；蛑亟M乙肝亞單位疫苗的研制成功，是開發(fā)新型疫苗的一個重要里程碑 ? 通過 基因敲除法 (knockout)產(chǎn)生的缺失特定受體的動物，發(fā)現(xiàn)其在脊椎動物發(fā)育中也起重要作用。如 GR基因敲除小鼠由于肺不張，于出生后短期內(nèi)死亡，其腎上腺缺少嗜鉻細胞，說明小鼠肺、腎上腺的發(fā)育與成熟需 GR參與。 ER缺陷的雄性小鼠睪丸較小，生精小管結構改變；雌性小鼠卵泡發(fā)育受損，說明精子發(fā)生過程和卵泡發(fā)育過程有ER參與