醫(yī)學超級全核醫(yī)學第六章-資料下載頁
2025-05-28 01:34本頁面
【正文】 反應試管對微量抗原、抗體的吸附。 ?：多功能的螯合劑，可以去除樣品中的鈣鎂離子。 ?％疊氮鈉：防腐劑。 73 （三）反應的溫度和時間 ?溫度升高，抗原抗體結合的親和力要下降，溫度每升高 10℃ ，抗原抗體結合達到平衡的速度約提高一倍，達到平衡的時間縮短，反應時間縮短。 ?溫度降低，親和常數(shù)提高，增加了反應的靈敏度。 74 （四）操作基本步驟 RIA的操作一般包括加樣、孵育、分離、測量和數(shù)據(jù)處理 5個部分。 1. 加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致 ， 所處的介質環(huán)境也要一致 。 2. 孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同 ， 一般是 37℃ 。 3. 分離：選擇好的分離方法進行分離 。 4. 測量：測量游離或結合物部分的放射性 。 5. 數(shù)據(jù)處理：繪制標準曲線和待測物濃度的計算。 75 免疫放射分析 immunoradiometric assay, IRMA 76 *Ab + Ag*Ab + *Ab Ag （ B） （ F） 在體外條件下 , 利用 Ag與過量的 *Ab的非競爭性結合反應，通過測定放射性復合物的量來計算出 Ag 量的一種超微量分析技術。 基本原理 77 基本原理 ? 免疫放射分析是一種非競爭性的抗原抗體反應，是用過量的放射性標記抗體來測定樣品中的抗原，其中標記抗體是過量的，抗原全部是非標記的。 ? 將放射性核素標記在抗體上，用過量的抗體與抗原結合，反應平衡后，用分離方法除去多余的抗體，測量抗原 標記抗體復合物的放射性。利用抗原 標記抗體復合物的放射性活度與抗原劑量之間的函數(shù)關系來測定待測抗原的量。 78 IRMA的基本方法 根據(jù) IRMA的分離方法一般可以分為： 雙抗夾心法 :（最常用） 將分離抗體涂在反應容器的壁上，稱固相抗體。固相抗體先于抗原反應，形成固相抗體－抗原復合物，再與標記抗體反應，形成固相抗體－抗原－標記抗體復合物附著在管壁上，傾去上清液直接測量反應容器的放射性。 79 80 標記第三抗體法： 用雙抗夾心法中的第二抗體（標記抗體）作為抗原免疫其他的動物獲得的抗體為第三抗體。反應后得到固相抗體－抗原－第二抗體－標記第三抗體的復合物。 一般第三抗體是由兔抗鼠 IgG的抗血清制成的，對于所有使用小鼠 IgG作為第二抗體的反應系統(tǒng)都能形成抗原抗體復合物，又稱為通用性標記抗體。 81 生物素－親和素系統(tǒng)： 一個抗體分子可以連接多個生物素分子，而每一個生物素分子都可以連接一個親和素且連接很緊密。用放射性核素標記親和素，可以使這個 IRMA系統(tǒng)的靈敏度大大提高。 82 IRMA和 RIA的區(qū)別 反應機制不同： RIA是競爭性反應； IRMA是非競爭性反應 反應試劑： RIA主要試劑有三種，標記的是抗原； IRMA主要試劑只有兩種，標記的是抗體。 83 分離方法不同： IRMA需要 2個或 2個以上的抗原決定簇； RIA只需要一個抗原決定簇。 劑量關系： 待測抗原復合物的放射性在 RIA中于待測抗原的量呈負相關； 在 IRMA中呈正相關。 84 反應中的 NSB： 在 RIA主要影響高劑量反應； 在 IRMA中主要影響低劑量反應。 擬合的標準曲線 擬合的 NSB 擬合的標準曲線 擬合的 NSB IRMA的標準曲線及非特異結合曲線 RIA的標準曲線及非特異結合曲線 85 RIA IRMA 競爭性抗原抗體結合反應 非競爭性抗原抗體結合反應 采用標記抗原 采用標記抗體 三種主要反應試劑 二種主要反應試劑 所用抗體是限量的 所用抗體是過量的 AgAb的量與待測 Ag的量呈負相關 AgAb的量與待測 Ag的量呈正相關 反應到達平衡慢 反應到達平衡快 非特異結合主要影響高劑量區(qū) 非特異結合主要影響低劑量區(qū) 低劑量區(qū)有不確定因素 低劑量區(qū)無不確定因素 IRMA與 RIA工作原理的主要區(qū)別 86 IRMA在實際應用中的特點 ? 標記物的穩(wěn)定性好：標記的是抗體 IgG蛋白分子，含有多個酪氨酸或組氨酸殘基，標記方法簡單，穩(wěn)定性好。 ? 反應動力學：非競爭性反應，且抗體是過量的，反應速度快，反應容易達到平衡，溫度變化對結果影響不大。 87 ? 靈敏度：理論上比 RIA高出 10～ 100倍。但是要求有良好的分離方法的保證。 ? 特異性：由于使用的是單克隆抗體，所以特異性一般比較高。 ? 加樣誤差：由于抗體是過量的，所以在 IRMA的加樣誤差主要來自抗原一個環(huán)節(jié)。而 RIA的抗體、待測抗原、標記抗原都可能產(chǎn)生加樣誤差。 88 ?優(yōu)點：是非競爭性反應 ， 靈敏度明顯高于 RIA。 ?缺點：需要特殊的分離方法。 由于 IRMA中要分離的是游離抗體和抗原抗體復合物，都屬于大分子，非特異的分離方法很難奏效。主要是靠單克隆抗體作為分離劑，因此在 IRMA系統(tǒng)中需要兩種抗體，至少需要兩個抗原決定簇，對小分子的半抗原不合適。
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